快速测定甜叶菊糖含量的方法及其专用试剂[发明专利]

[12]发明专利申请公开说明书

[21]申请号200510010277.3

[51]Int.CI.

G01N 21/31 (2006.01)G01N 1/28 (2006.01)

[43]公开日2006年2月8日[22]申请日2005.08.24[21]申请号200510010277.3

[71]申请人郝再彬

地址150030黑龙江省哈尔滨市香坊区木材街59

号东北农业大学生命科学学院[72]发明人郝再彬 苍晶 一井真比古 武田真

[11]公开号CN 1731144A

[74]专利代理机构哈尔滨市哈科专利事务所有限责任

公司

代理人祖玉清

权利要求书 2 页 说明书 5 页 附图 1 页

[]发明名称

快速测定甜叶菊糖含量的方法及其专用试剂[57]摘要

本发明提供的是一种快速测定甜叶菊糖含量的方法及其专用试剂。首先配制测定用试剂，分别制备出1％葡萄糖及 1％甜叶菊糖标准液母液；用母液制备出不同浓度的溶液，向这些不同浓度的溶液中添加测定用试剂测定，在50℃和100℃温度下反应；之后利用分光光度计在波长0nm下测定出它们的消光值，制作出浓度和消光值之间的标准曲线，得到标准曲线的计算公式；其次配制未知样品溶液，按照制作标准曲线的方法进行；通过标准曲线或计算公式计算出未知样品中甜叶菊糖浓度。本发明的方法可以用来测定甜叶菊糖；应用领域广泛，可以应用于工业、农业、原料收购及相关终端产品等的测定。

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权 利 要 求 书

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1、一种快速测定甜叶菊糖含量的方法，其特征是：首先配制测定用试剂，分别制备出1％葡萄糖及1％甜叶菊糖标准液母液；用母液制备出不同浓度的溶液，向这些不同浓度的溶液中添加测定用试剂测定，在50℃和100℃温度下反应；之后利用分光光度计在波长0nm下测定出它们的消光值，制作出浓度和消光值之间的标准曲线，得到标准曲线的计算公式；其次配制未知样品溶液，按照制作标准曲线的方法进行；通过标准曲线或计算公式计算出未知样品中甜叶菊糖浓度。 2、根据权利要求1所述的快速测定甜叶菊糖含量的方法，其特征是：所述的测定用试剂为：将200g酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·5H2O)与10-30g氢氧化钠(NaOH)溶于0.8L蒸馏水中；搅拌加热下，将3，5-二硝基水杨酸(DNS)3-9g、结晶酚(苯酚)1-8g、亚硫酸钠(Na2SO3)1-8g，先后于溶液中溶解；最后再加入铁[K3Fe(CN)6]2-5g使其溶解，冷却后加蒸馏水定容至1L所得到的溶液。

3、根据权利要求1或2所述的快速测定甜叶菊糖含量的方法，其特征是：所述的其测定过程为：葡萄糖、甜叶菊糖标准样品和测定用试剂在体积为5ml的离心管中摇匀，100℃水浴加热10分钟，取出后立即放入4℃冰箱中冷却，之后各管在天平上以蒸馏水定重量至4.0g，加盖后颠倒混匀；在0nm波长下，测定消光值；以浓度为横坐标，消光值为纵坐标，分别绘制出葡萄糖、甜叶菊糖的标准曲线，求得直线方程；同时做出50℃下葡萄糖标准曲线，求得直线方程；未知样品用同样方法进行。

4、一种快速测定甜叶菊糖含量的方法的专用试剂，其特征是：它是200g酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·5H2O)与10-30g氢氧化钠(NaOH)溶于0.8L蒸馏水中；搅拌加热下，将3，5-二硝基水杨酸(DNS)3-9g、结晶酚(苯酚)1-8g、亚硫酸钠(Na2SO3)1-8g，先后于溶液中溶解；最后再加入铁[K3Fe(CN)6]2-5g使其溶解，冷却后加蒸馏水定容至1L所得到的溶液。

5、根据权利要求4所述的快速测定甜叶菊糖含量的方法的专用试剂，其特征是：它是200g酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·5H2O)与20g氢氧化钠(NaOH)溶于0.8L蒸馏水中；搅拌加热下，将3，5-二硝基水杨酸(DNS)6g、结晶酚(苯酚)5g、亚硫酸钠(Na2SO3)5g，先后于溶液中溶解；

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最后再加入铁[K3Fe(CN)6]3.2g使其溶解，冷却后加蒸馏水定容至1L所得到的溶液。

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说 明 书

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快速测定甜叶菊糖含量的方法及其专用试剂

(一)技术领域

本发明涉及的是一种检测方法，具体地说是一种甜叶菊糖(也称甜菊糖、甜叶菊糖、甜叶菊糖苷、甜叶菊糖甙)含量的快速检测方法。本发明也涉及这种检测方法的专用试剂。 (二)背景技术

目前糖尿病患者逐渐增加，另外正常人过量摄取可吸收性糖也不利于身体健康，为此具有与蔗糖口感相近，同时为非吸收性糖的甜味剂开发利用是今后的发展方向。

在世界上许可添加的几大类甜味剂中，一半来自化工合成，另一半来自于天然植物。随着人们生活水平的不断提高，越来越倾向于使用天然植物量甜味剂。

在天然植物量甜味剂中甜度比较高的有甜叶菊植物，其糖作为甜味剂应用也是近十几年的事。甜叶菊植物中有7种甜味成分，但主要含量是蔗糖甜度300倍的St(Stevioside)和450倍的RA(RebaudiosideA，或称为甜菊A3：Stevioside A3)。由于它们的特性而被应用于食品、保健品、药品、化妆品、抗氧化食用商品、饲料添加剂。 随着甜菊糖应用范围不断地扩大，快速检测手段也越来越受重视。目前分析检测方法有(1)分光光度计比色(黄海水，林静1990；付宝忠，史立华1995；项秀珠，郭秀珠1996)、(2)薄层色谱(黄雨三2003)、(3)高压液相色谱(黄晓兰，倪尔葭1990)、(4)毛细管电泳(邵寒娟，胡涌刚2001)等方法。薄层色谱法的化学试剂比较多，适合于小样品的纯化。高压液相色谱法和毛细管电泳法仪器比较贵，同时要有该专业技术人员，一般甜叶菊糖加工厂不易实现。它们都不方便携带，在农业甜叶菊的育种和栽培生产中的随时监控比较困难。这3种方法适合于大学及研究所对甜菊糖的研究；相比之下，分光光度计比色法操作简单，检测成本低，容易克服上述不足，做常规性测定易于被生产厂家所应用。 原理：在煮沸的碱性溶液中，还原糖(具有醛基或酮基)使3，5-二硝基水杨酸成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的含量和棕红色物的颜色深浅的程度成一定比例关系。0nm波长下测定棕红色物质

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的消光值，查标准曲线，可求出样品中还原糖的含量。这是许多生物化学实验指导书中还原糖的分光光度计比色测定方法(郝再彬等2004；入村达郎等2004)。

植物体内的还原糖主要是单糖(葡萄糖和果糖)、双糖(麦芽糖、异麦芽糖、纤维二糖)。葡萄糖有6个碳原子、一个醛基；果糖有6个碳原子、一个酮基；麦芽糖由两个葡萄糖分子以α-1，4-键相结合、含一个醛基；异麦芽糖由两个葡萄糖分子以α-1，6-键相结合、含一个醛基；纤维二糖由两个葡萄糖分子以β-1，4-键相结合、含一个醛基。蔗糖是非还原糖，由葡萄糖和果糖分子以α-1，2-键相结合，与3，5-二硝基水杨酸没有呈色反应。

根据上述理论，我们认为相同浓度摩尔的葡萄糖和麦芽糖所含的醛基数量相同时，0nm波长下、3，5-二硝基水杨酸方法测定它们的消光值应该相等，葡萄糖和麦芽糖两条标准曲线斜率也应该相同；然而，我们发现它们不相等，麦芽糖的消光值数据大于葡萄糖。即在麦芽糖分子中除醛基之外还有其他基团与测定试剂发生了反应，从而导致消光值数据大于葡萄糖。由此，我们利用该原理发明了3，5-二硝基水杨酸和铁方法测定甜叶菊糖。

根据上述发现，测定甜叶菊糖的发明做如下说明。

甜叶菊糖(主要是两种成分，St和RA。St、RA的分子结构分别见图1、2)为甜菊醇苷体与两个配糖体(R1、R2)相结合。St的R1和R2配糖体分别是一个葡萄糖和α-1，2-键相结合两个葡萄糖；RA是在St的基础上R2配糖体除α-1，2-键外又增加了一个α-1，3-键相结合三个葡萄糖。在甜叶菊糖(St、RA)分子中无游离醛基和酮基结构，传统的还原糖测定方法表明：这种分子结构的甜叶菊糖与还原糖测定试剂没有反应，因此也不能用于甜叶菊糖的定量分析。但是，我们发现了它们之间有反应。

另外，甜叶菊糖的粗提取物样品中常常含有还原糖，该还原糖对甜叶菊糖定量有影响，为此发明了在不同温度下让它们反应，从而将它们分别定量。既用两组样品，加入测定试剂之后，一组样品在50℃加热1小时(或25℃-30℃的室温下放置24小时)，另一组样品在100℃加热10分钟。前者还原糖有呈色反应，而甜叶菊糖没有反应；后者还原糖和甜叶菊糖都有呈色反应。 (三)发明内容

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本发明的目的在于提供一种用分光光度计比色法快速测定甜叶菊糖含量的方法。本发明的目的还在于提供快速测定甜叶菊糖含量的方法的专用试剂。

本发明的目的是这样实现的：首先配制测定用试剂，分别制备出1％葡萄糖及1％甜叶菊糖标准液母液；用母液制备出不同浓度的溶液，向这些不同浓度的溶液中添加测定用试剂测定，在50℃和100℃温度下反应；之后利用分光光度计在波长0nm下测定出它们的消光值，制作出浓度和消光值之间的标准曲线，得到标准曲线的计算公式；其次配制未知样品溶液，按照制作标准曲线的方法进行；通过标准曲线或计算公式计算出未知样品中甜叶菊糖浓度。 本发明还可以包括：

1、所述的测定用试剂为：将200g酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·5H2O)与10-30g氢氧化钠(NaOH)溶于0.8L蒸馏水中；搅拌加热下，将3，5-二硝基水杨酸(DNS)3-9g、结晶酚(苯酚)1-8g、亚硫酸钠(Na2SO3)1-8g，先后于溶液中溶解；最后再加入铁[K3Fe(CN)6]2-5g使其溶解，冷却后加蒸馏水定容至1L所得到的溶液。

2、所述的其测定过程为：葡萄糖、甜叶菊糖标准样品和测定用试剂在体积为5ml的离心管中摇匀，100℃水浴加热10分钟，取出后立即放入4℃冰箱中冷却，之后各管在天平上以蒸馏水定重量至4.0g，加盖后颠倒混匀；在0nm波长下，测定消光值；以浓度为横坐标，消光值为纵坐标，分别绘制出葡萄糖、甜叶菊糖的标准曲线，求得直线方程；同时做出50℃下葡萄糖标准曲线，求得直线方程；未知样品用同样方法进行。

发明方法的原理：甜叶菊糖(主要是两种成分，St和RA。St、RA的分子结构分别见图1、2)为甜菊醇苷体与两个配糖体(R1、R2)相结合。St的R1和R2配糖体分别是一个葡萄糖和α-1，2-键相结合两个葡萄糖；RA是在St的基础上R2配糖体除α-1，2-键外又增加了一个α-1，3-键相结合三个葡萄糖。在甜叶菊糖(St、RA)分子中无游离醛基和酮基结构，但是能与测定还原糖的试剂反应，从而进行定量。甜叶菊糖的粗提取物样品中常常含有还原糖，该还原糖对甜叶菊糖定量有影响，为此用两组样品，加入测定试剂之后，一组样品在50℃加热1小时(或25℃-30℃的室温下放置24小时)，另一组样品在100℃加热10分钟。前者还原糖有呈色反应，而甜叶菊糖没有反应；后者还原糖和甜叶菊糖都

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有呈色反应。

本发明的方法可以用来测定甜叶菊糖(也称甜菊糖、甜叶菊糖苷、甜叶菊糖甙)。

本发明的方法应用领域广泛，可以应用于：

1)工业：甜叶菊糖的提取、纯化等工业化生产的随时监控； 2)农业：在甜叶菊栽培和育种的种植中，甜叶菊糖含量质量监控； 3)原料收购：收购甜叶菊叶片(或茎秆)时，其中的甜叶菊糖含量测定；

4)相关终端产品：在食品、保健品、药品、化妆品、添加甜叶菊糖的抗氧化商品以及饲料添加剂中，甜叶菊糖被浓缩之后用该方法测定等。 (四)附图说明

附图是甜叶菊糖苷的分子结构。其中R是H时为St、R是葡萄糖时为RA。

(五)具体实施方案

下面对本发明做更详细的描述： 1.材料：甜叶菊叶片或甜叶菊糖粉。

2.仪器设备：分光光度计；分析天平；离心机；水浴锅；5ml离心管；容量瓶；研钵。

3.试剂和标准液：(1)测定用试剂：200g酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·5H2O)与20g NaOH溶于0.8L蒸馏水中。搅拌加热下，将3，5-二硝基水杨酸(DNS)6g，结晶酚(苯酚)5g，亚硫酸钠(Na2SO3)5g，先后于溶液中溶解。最后再加入铁(K3Fe(CN)6)3.2g使其溶解，冷却后加蒸馏水定容至1L，贮于棕色瓶中备用；备用试剂出现混浊时要过滤。(2)标准液：80℃下烘至恒重的葡萄糖、甜叶菊糖各100mg，分别加蒸馏水溶解，定容至10ml，摇匀后置冰箱中保存备用。

4.标准曲线制备：将7支5ml离心管编号，按下表所示的量精确加入浓度为10mg·mL的标准液和测定试剂。将各管摇匀，在100℃加热10分钟，取出后立即放入4℃冰箱中冷却，之后各管在天平上以蒸馏水定重量至4g，加盖后颠倒混匀。在0nm波长下，用0号管调零，分别读取1～6号管的消光值。以消光值为纵坐标，浓度为横坐标，分别绘制出葡萄糖、甜叶菊糖的标准曲线，求得直线方程。同时做出50℃下葡萄糖标准曲线，求得直线方程。

5.样品中糖的提取：准确称取1g样品，放在100ml的烧杯中，先以少

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量蒸馏水调制，然后加50ml蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20分钟，使糖浸出，搅匀后于4000rpm离心10分钟，离心的上清液收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为待测液。叶片样品至少要105℃干燥3个小时以上，再进行上述过程。                    表1各试管加溶液的量

管号             0      1      2      3      4      5      6 标准液(μl)      0      20     40     60     80     100    120 水(μl)          200    180    160    140    120    100    80 测定试剂(μl)    200    200    200    200    200    200    200 标准量(mg)       0      0.2    0.4    0.6    0.8    1.0    1.2                                定容到4.0g后

标准量(mg/ml)    0      0.05   0.10   0.15   0.20   0.25   0.30

注意：表中各量是根据分光光度计比色杯厚度为0.8-1.0cm设计的。 6.计算：待测液的比色方法与标准曲线的方法相同。比色后根据消光值、标准曲线或计算公式即可计算出样品中甜叶菊糖浓度。 按下式计算百分含量：

(1)、根据50℃下葡萄糖标准曲线方程求得50℃下还原糖量； 50℃下还原糖量A(％)＝(C50)·V0(1000V1·W) 式中C5

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：50℃下标准曲线方程求得的还原糖量(mg)；

    V0：提取液的体积(ml)

    V1：显色时吸取样品液体积(ml)；     W：样品重(g)。

(2)、根据100℃下葡萄糖标准曲线方程求出C50的消光值为B； (3)、100℃下葡萄糖和甜叶菊糖共存下的消光值为C； (4)、100℃下甜叶菊糖消光值C-B＝D；

(5)、根据100℃下甜叶菊糖标准曲线方程求出甜叶菊糖百分含量；           甜叶菊糖(％)＝(C100)·V0(1000V1·W)(mg)；

    V0：提取液的体积(ml)

    V1：显色时吸取样品液体积(ml)；     W：样品重(g)。

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-1

式中C100：根据消光值D，100℃下标准曲线方程求得的甜叶菊糖

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说 明 书 附 图

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