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解析和定量无细胞RNA的方法[发明专利]

来源：吉趣旅游网

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 104334742 A(43)申请公布日 2015.02.04

(21)申请号 2013800175.6(22)申请日 2013.01.28(30)优先权数据

61/591,2 2012.01.27 US(85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.09.28

(86)PCT国际申请的申请数据

PCT/US2013/023471 2013.01.28(87)PCT国际申请的公布数据

WO2013/113012 EN 2013.08.01(71)申请人利兰斯坦福青年大学董事会

地址美国加利福尼亚州(72)发明人L·C·W·蔻 S·R·魁克(74)专利代理机构北京三友知识产权代理有限

公司 11127

代理人韩蕾

权利要求书2页说明书15页附图168页权利要求书2页说明书15页附图168页

(51)Int.Cl.

C12Q 1/68(2006.01)C40B 30/04(2006.01)

()发明名称

解析和定量无细胞RNA的方法(57)摘要

本发明大体上涉及通过表征生物样品中的循环核酸来评估组织的健康状况的方法。根据某些实施例，评估组织的健康状况的方法包括以下步骤：检测生物样品中的RNA的样品含量，比较RNA的样品含量与对所述组织具有特异性的RNA的参考含量，确定在所述样品含量与所述参考含量之间是否存在差值，且如果检测到差值则将所述组织表征为异常。

CN 104334742 A CN 104334742 A

权利要求书

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1.一种评估组织的健康状况的方法，所述方法包含

检测生物样品中的RNA的样品含量；

比较RNA的所述样品含量与对所述组织具有特异性的RNA的参考含量；确定在所述样品含量与所述参考含量之间是否存在差值；以及如果检测到差值则将所述组织表征为异常。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含监测所述组织以得到疾病进展的步骤。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述参考含量对应于所述组织在一个时间点的状态。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述参考含量为对于健康状态下的所述组织具有特异性的RNA的含量。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品为血液、血液组分、唾液、痰液、尿液、精液、经阴道体液、脑脊髓液、粪便、细胞或组织活检。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述生物样品为血液。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述RNA为无细胞RNA。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测步骤是借助测序技术、微阵列技术或两者来进行。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述测序技术为全转录组鸟法测序。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述参考含量是通过计算机生成的数据库来确定。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织是选自由以下组成的组：全血、骨髓、下丘脑、平滑肌、肺脏、胸腺、淋巴结和甲状腺。

12.一种评估组织的健康状况的方法，所述方法包含如果血液中存在规定含量的RNA则将所述组织表征为异常。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述组织是选自由以下组成的组：全血、骨髓、下丘脑、平滑肌、肺脏、胸腺、淋巴结和甲状腺。

14.根据权利要求12所述的方法，其进一步包含检测血液样品中的RNA的含量；

比较RNA的样品含量与对组织具有特异性的RNA的参考含量；确定在所述样品含量与所述参考含量之间是否存在差值，以及

如果所述样品含量和所述参考含量相同则将所述组织表征为异常。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述参考含量指示疾病或病状。16.根据权利要求12所述的方法，其中所述RNA为无细胞RNA。17.根据权利要求12所述的方法，其中所述检测步骤是借助测序技术、微阵列技术或两者来进行。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述测序技术为全转录组鸟法测序。19.根据权利要求14所述的方法，其中所述参考含量是通过计算机生成的数据库来确定。

20.一种从包含来自不同基因组来源的基因材料混合物的生物样品检测差异性转录物含量的方法，所述方法包含以下步骤：

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权利要求书

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a)在不同时间点获得多个生物样品，每个样品含有来自不同基因组来源的基因材料的混合物；

b)扩增来自所述多个生物样品的多个RNA转录物以获得多个扩增样品，每个扩增样品含有来自不同基因组来源的扩增RNA转录物的混合物；

c)检测来自所述扩增样品中的每一个的所述RNA转录物中的一或多个的含量；以及d)进行比较所述扩增样品中的每一个之间的所述RNA转录物中的一或多个的含量的分析以确定在不同时间点所检测的RNA转录物中的一或多个的差异性图谱。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述生物样品为血液、血液组分、唾液、痰液、尿液、精液、经阴道体液、脑脊髓液、粪便、细胞或组织活检。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述生物样品为血液。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述血液为来源于孕妇的外周血液或其组分。24.根据权利要求20所述的方法，其中所述不同基因组来源来源于妊娠女性和胎儿。25.根据权利要求20所述的方法，其中所述检测步骤是借助测序技术、微阵列技术或两者来进行。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述测序技术为全转录组鸟法测序。27.根据权利要求25所述的方法，其中一或多个RNA转录物的所述差异性图谱指示疾病或病状。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述疾病或病状为早产妊娠。29.根据权利要求27所述的方法，其中所述疾病或病状为病理性妊娠。30.根据权利要求27所述的方法，其中所述差异性图谱包括由以下组成的族群中选出的一或多个基因：PVALB、CLCN3、ITGA2B、LTV1、HIST1H4B、TREML1、NPTN、LSM2、SCGB1C1、NOP10、MFSD1、MALAT1、GDI1、HIST1H1C、HIST1H4H、CD226、ITM2B、MLLT6、ANO6和ITGB3。

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说明书

解析和定量无细胞RNA的方法

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相关申请案

[0002] 本申请案主张在2012年1月27日申请的美国临时专利申请案序号61/591,2的权益和优先权，所述美国临时专利申请案的全部内容以引用的方式并入在此。

[0001]

技术领域

[0003] 本发明涉及含基因材料的生物样品中的核酸分析的领域。具体来说，本发明的方法涉及定量生物样品中的组织特异性核酸。

背景技术

[0004] 判断个体体内器官的健康状况常常具有挑战性。医生常常被强制使用昂贵成像技术或进行针对癌症筛查的侵入性活检以识别诊断性生物标记物且监测肿瘤起始和进展。活检的侵入性性质使其不适于患者的普遍筛查。另外，许多诊断性生物标记物仅在癌细胞系中或从获自患有晚期疾病和癌转移的患者的活检样本识别。

[0005] 已研究针对存在于癌症患者的血浆和血清中可检测的循环核酸(DNA和RNA)以充当用于诊断性目的的标记物的潜在用途，其具有作为非侵入性诊断性工具的明显益处。已显示血浆内的标记物与在患者的致癌组织中所发现的标记物一致。由于RNA标记物与恶性肿瘤紧密关联，故用于早期检测癌症筛查的循环RNA尤其受关注。[0006] 除癌症检测以外，存在于母体血浆中的胎儿特异性无细胞RNA的发现已打开关于产前分子诊断的新视野(参看例如潘等人,临床化学,46(11):1832-1834(2000)(Poon et al,Clinical Chemistry,46(11):1832-1834(2000)))。具体来说，血浆RNA的分析为胎儿的非侵入性基因表达解析带来希望。然而，迄今仅少数妊娠特异性无细胞RNA转录物已表征。尚未进行这类RNA的综合解析。

[0007] 分析非母体和母体血液中的无细胞RNA的一个问题为缺乏合适的数据来估计无细胞RNA存在的生物原因。例如，缺乏确定血液中所存在的无细胞RNA的组织来源的可靠方法。发明内容

[0008]

本发明提供解析无细胞RNA的来源以评估器官或组织的健康状况的方法。正常无

细胞转录组中的偏离是在随着器官/组织开始衰竭或被免疫系统或病原体攻击使那些器官/组织特异性转录物大量释放到血液中时引起的。因此，发炎过程可作为身体对这些有害刺激的复杂生物反应的一部分而发生。根据某些方面，本发明利用健康个体的组织特异性RNA转录物推断在正常无细胞转录组中不同组织的相对最优比重，且样品的各个组织特异性RNA转录物指示所述组织的凋亡速率。正常无细胞转录组充当评估其他个体的组织健康状况的基线或参考含量。本发明包括样品的无细胞转录组与正常无细胞转录组的比较测量，用以评估在血浆中循环的组织特异性转录物的样品含量且用以评估对无细胞转录组起作用的组织的健康状况。

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说明书

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除正常参考含量以外，本发明的方法还利用对其他患者群体具有特异性的无细胞转录组的参考含量。使用本发明的方法，人们可确定组织特异性转录物对母体个体、胎儿个体和/或患有病状或疾病的个体的无细胞转录组的相对比重。[0010] 通过基于组织特异性转录物来分析组织的健康状况，本发明的方法有利地允许人们无需依赖于疾病相关蛋白质生物标记物而评估组织的健康状况。在某些方面，本发明的方法通过以下步骤评估组织的健康状况：比较生物样品中的RNA的样品含量与对组织具有特异性的RNA的参考含量，确定在样品含量与参考含量之间是否存在差值，且如果检测到差值则将组织表征为异常。例如，如果患者的特异性组织的RNA表达含量不同于正常无细胞转录组中的特异性组织的RNA表达含量，此指示患者的组织功能不正常。[0011] 在某些方面，本发明的方法涉及通过如果血液中存在规定含量的RNA则将组织表征为异常来评估组织的健康状况。所述方法可进一步包括检测血液样品中的RNA的含量，比较RNA的样品含量与对组织具有特异性的RNA的参考含量，确定在样品含量与参考含量之间是否存在差值，且如果样品含量与参考含量相同则将组织表征为异常。

[0012] 本发明还提供综合解析母体血浆中的胎儿特异性无细胞RNA和使用与不同胎儿组织类型的相关比例来解卷积胎儿来源的无细胞转录组的方法。本发明的方法涉及使用下一代测序技术和/或微阵列表征在妊娠的不同阶段存在于母体血浆中的无细胞RNA转录物。这些转录物的定量允许人们推断在整个不同的妊娠期中这些基因的变化，且从而提供转录物中的时间变化的定量方式。

[0013] 本发明的方法实现针对妊娠期间或之后的并发症的可能性的诊断和识别。方法还实现依次阐明母体和胎儿发育程序的妊娠相关联转录物的识别。本发明的方法适用于早产诊断以及大体上与胎儿发育轨迹关联的转录谱的阐明。由此，本发明的方法适用于表征胎儿发育且不限于仅疾病病况或与妊娠关联的并发症的表征。所述方法的示例性实施例描述于实施方式、权利要求和下文提供的图中。附图说明

[0014] 图1描绘前面检测的女性妊娠相关联的差异性表达转录物的列表。

[0015] 图2显示在实例1中获得的无细胞RNA转录物含量的两个主要主成分的曲线。[0016] 图3A描绘使用微阵列在早产和正常妊娠中展现不同时间含量的前100种无细胞转录物含量的热图。

[0017] 图3B描绘使用RNA测序在早产和正常妊娠中展现不同时间含量的前100种无细胞转录物含量的热图。

[0018] 图4描绘在早产与正常妊娠之间差异性表达的前20种转录物的排列。[0019] 图5描绘关于图4的前20种常见RNA转录物的基因本体分析的结果，显示连接(整合或松散地结合)到质膜或连接在血小板的膜上的蛋白质的那些富集转录物。

[0020] 图6描绘在整个不同妊娠期中PVALB的基因表达谱显示相比于正常妊娠发现早产[以蓝色突出]具有较高的无细胞RNA转录物含量。

[0021] 图7概述确定占样品的无细胞转录组的相对组织比重的示例性方法步骤。[0022] 图8描绘在实例2中产生的一组选定的胎儿组织特异性转录物。

[0023] 图9A和图9B描绘使用实际无细胞RNA以及相同无细胞RNA的cDNA库的胎儿组织

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说明书

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特异性转录物的平行定量的原始数据，所述原始数据显示在整个母体时间点(早期妊娠、中期妊娠、晚期妊娠和分娩后)的变化。

[0024] 图10说明整个母体时间点(早期妊娠、中期妊娠、晚期妊娠和分娩后)中胎盘基因的相对表达量。

[0025] 图11说明整个母体时间点(早期妊娠、中期妊娠、晚期妊娠和分娩后)中胎儿大脑基因的相对表达量。

[0026] 图12说明整个母体时间点(早期妊娠、中期妊娠、晚期妊娠和分娩后)中胎儿肝脏基因的相对表达量。

[0027] 图13说明不同器官占血浆成人无细胞转录组的比重的相对组成。

[0028] 图14说明使用RNA测序数据得到的器官占血浆成人无细胞转录组的比重的分解。[0029] 图15描绘使用定量聚合酶链反应(qPCR)验证的实例3中的一组94种组织特异性基因。

[0030] 图16显示图15的组织特异性转录物的热图，所述组织特异性转录物在无细胞RNA中可检测。

[0031] 图17描绘根据某些实施例的此方法的流程图。

[0032] 图18描绘使用来自人类U133A/GNF1H基因阿特拉斯(Human U133A/GNF1H Gene Atlas)和RNA测序阿特拉斯(RNA-Seq Atlas)数据库的原始数据获得的实例3的组织特异性基因的列表。

具体实施方式

[0033] 在此所描述的方法和材料应用下一代测序和微阵列技术的组合用于检测、定量和表征存在于生物样品中的RNA序列。在某些实施例中，生物样品含有来自不同基因组来源(即妊娠女性和胎儿)的基因材料的混合物。

[0034] 不同于其他以较小反应体积使样品中的核酸分离成标称单个目标分子的数字分析方法，本发明的方法在无需稀释或分散样品中的基因材料的情况下进行。本发明的方法允许多个转录组同时筛查，且提供各个转录物在单个核苷酸水平下的信息性序列信息，由此根据有限量的生物样品提供针对个体中的广泛范围疾病或病状的非侵入性、高处理量筛查的能力。

[0035] 在一个特定实施例中，本发明的方法涉及分析母体血液中的混合胎儿和母体RNA以识别在整个不同妊娠阶段中差异性表达的转录物，所述差异性表达的转录物可指示早产或病理性妊娠。通过在整个妊娠的不同阶段中分离和扩增来自母体血液的血浆RNA且借助微阵列和RNA测序来定量和表征所分离的转录物而部分实现转录物的差异性检测。如在此所描述的特异性针对分析含有RNA(包括非母体、母体、母体-胎儿混合)

的生物样品的方法和材料仅为本发明的方法可如何应用的一个实例且并不打算本发明。本发明的方法还适用于使用血液、粪便、痰液、尿液、经阴道体液、乳房乳头吸液、脑脊髓液等中的无细胞RNA筛查与癌症诊断、进展和/或预后相关的靶基因的差异性表达。[0037] 在某些实施例中，本发明的方法大体上包括以下步骤：获得含有来自不同基因组来源的基因材料的生物样品，从含有来自不同基因组来源的基因材料的混合物的生物样品分离总RNA，从总RNA制备扩增的cDNA，对扩增的cDNA进行测序，且数字计数和分析并解析

[0036]

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说明书

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扩增的cDNA。

[0038] 本发明的方法还涉及评估占无细胞转录组比重的组织的健康状况。在某些实施例中，本发明涉及评估生物样品的无细胞转录组以确定个别组织对无细胞转录组的组织特异性比重。根据某些方面，本发明通过检测生物样品中的RNA的样品含量，比较RNA的样品含量与对组织具有特异性的RNA的参考含量且如果检测到差值则将组织表征为异常来评估组织的健康状况。此方法适用于表征非母体个体、妊娠个体和存活胎儿中的组织的健康状况。图17描绘根据某些实施例的此方法的流程图。[0039] 在某些方面，本发明的方法采用参考无细胞RNA转录组的解卷积来确定组织的参考含量。优选地，参考无细胞RNA转录组为正常、健康的转录组，且组织的参考含量为健康、正常的个体的血液中存在的对组织具有特异性的RNA的相对含量。本发明的方法假设来自不同组织类型的凋亡细胞释放其RNA到个体的血浆中。这些组织中的每一个表达特定数目的对所述组织类型来说独特的基因，且个体的无细胞RNA转录组为不同组织类型的总和。每一组织可表达一或多个数目的基因。在某些实施例中，参考含量为与通过某一组织表达的基因中的一者关联的含量。在其他实施例中，参考含量为与通过某一组织表达的多种基因关联的含量。应注意存在于循环RNA中的组织特异性转录物的参考含量或临限量可为零或正数。

[0040] 对于健康、正常的个体，来自不同组织类型的循环RNA的相对比重是相对稳定的，且正常个体的无细胞RNA转录组的各个组织特异性RNA转录物可充当所述组织的参考含量。应用本发明的方法，如果样品包括不同于对组织具有特异性的RNA参考含量的RNA含量则将所述组织表征为不健康或异常的。如果RNA的实际含量在统计上不同于参考含量则可将样品的组织表征为不健康的。统计显著性可通过此项技术中已知的任何方法来确定。这些测量可用以筛查器官健康状况，作为诊断性工具和作为测量对药物的反应或在临床试验中监测健康状况的工具。

[0041] 如果检测到RNA的样品含量与RNA的参考含量之间的差值，则这类差值表明相关联组织功能不正常。循环RNA中的变化可为器官衰竭的前兆或指示组织正受免疫系统或病原体的攻击。如果组织被识别为异常，则根据某些实施例下一步骤可包括更多深入的组织测试(例如组织的侵入性活检)，开对所述组织具有特异性的疗程处方和/或组织的例行监测。

[0042] 本发明的方法可用以非侵入性推断器官健康状况。此非侵入性测试可用以筛查阑尾炎、初期糖尿病和通过糖尿病诱发的病理性病状(例如肾病、神经病、视网膜病等)。另外，本发明可用以确定器官移植中的移植物抗宿主疾病的存在，尤其在新免疫系统攻击皮肤、胃肠道或肝脏的骨髓移植接受者中。本发明还可用于监测实体器官(例如心脏、肺脏和肾脏)移植接受者的健康状况。本发明的方法可评估妊娠和胎儿发育中的早产、子痫前期和异常的可能性。另外，本发明的方法可用于识别和监测涉及细胞特异性死亡(例如神经元或因脱髓鞘所致的)或涉及血小板或蛋白质凝集物的产生的神经性病症(例如多发性硬化症和阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease))。

[0043] 用于确定组织特异性转录物的参考含量的目的的无细胞转录组可为一或多个正常个体、母体个体、患有某一病状和疾病的个体或胎儿个体的无细胞转录组。就某些病状来说，组织的参考含量为存在于一或多个患有某一疾病或病状的个体的血液中的对所述组织

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具有特异性的RNA的含量。在这类方面中，方法包括检测血液中的RNA的含量，比较RNA的样品含量与对组织具有特异性的RNA的参考含量，确定在样品含量与参考含量之间是否存在差值，且如果样品含量与参考含量相同则将表征为异常。

[0044] 无细胞转录组的解卷积用于确定各个组织类型占无细胞RNA转录组的相对比重。采用以下步骤以确定样品中的某些组织的相对RNA比重。第一，识别一组组织特异性转录物。第二，使用此项技术中已知的方法确定来自样品的血浆中的总RNA。第三，根据这一组组织特异性转录物评估总RNA，且将总RNA视为这些不同组织特异性转录物的总和。二次规划可以用作推断不同器官/组织占样品的无细胞转录组的相对最优比重的限定最优化方法。

[0045] 可将一或多个基因信息数据库用以识别一组组织特异性转录物。因此，本发明的方面提供关于数据库的使用和研发的系统和方法。确切地说，本发明的方法利用含有遍及组织类型产生的现存数据的数据库来识别组织特异性基因。组织特异性基因的识别所利用的数据库包括人类133A/GNF1H基因阿特拉斯和RNA测序阿特拉斯，但可以使用任何其他数据库或文献。为了从一或多个数据库识别组织特异性转录物，某些实施例采用数据库的模板匹配算法。用于过滤数据的模板匹配算法为此项技术中已知，参看例如帕夫利迪斯P,诺贝尔WS(2001)小鼠大脑中基因表达的应变和地区性变化的分析.基因组生物学2:研究0042.1-0042.15(Pavlidis P,Noble WS(2001)Analysis of strain and regional variation in gene expression in mouse brain.Genome Biol 2:research0042.1-0042.15)。[0046] 在某些实施例中，将二次规划用作推断不同器官/组织占样品中的无细胞转录组的相对最优比重的限定最优化方法。二次规划为此项技术中已知且详细描述于戈德法布和A.伊德纳尼(1982).解决严格凸二次规划的对偶和原始对偶方法.因J.P.亨纳特(编),数值分析,施普林格出版社,柏林,第226-239页(Goldfarb and A.Idnani(1982).Dual and Primal-Dual Methods for Solving Strictly Convex Quadratic Programs.In J.P.Hennart(ed.),Numerical Analysis,Springer-Verlag,Berlin,pages226-239)和D.戈德法布和A.伊德纳尼(1983).解决严格凸二次规划的数值稳定对偶方法.数学规划,27,1-33(D.Goldfarb and A.Idnani(1983).A numerically stable dual method for solving strictly convex quadratic programs.Mathematical Programming,27,1-33)中。

[0047] 图7概述确定占样品的无细胞转录组的相对组织比重的示例性方法步骤。使用由一或多个组织特异性数据库提供的信息，用模板匹配函数产生一组组织特异性基因。可应用质量控制函数来过滤结果。随后分析血液样品以确定各组织特异性转录物占样品的总RNA的相对比重。从样品提取无细胞RNA，且使用一或多种定量技术(例如标准微阵列和RNA测序方案)来处理无细胞RNA提取物。随后归一化所获得的样品的基因表达值。此涉及对管家基因的全部基因表达值的重新按比例缩放。然后，使用二次规划针对一组组织特异性基因评估样品的总RNA以便确定占样品的无细胞转录组的组织特异性相对比重。在二次规划分析期间采用以下来获得估计的相对比重：a)不同组织的RNA比重大于或等于零，和b)占无细胞转录组的全部比重的总和等于一。

[0048] 用于确定各个组织的相对比重的本发明的方法可用以确定组织的参考含量。也就

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是说，可对某一个体群体(例如母体的、正常的和癌性的)进行在图7中概述的解卷积方法以获得所述患者群体的组织特异性基因表达的参考含量。在单独考虑相对组织比重时，这些组织特异性转录物中的每一个的定量可以用作特定群体的特定组织的参考凋亡速率的量度。例如，可分析来自一或多个健康、正常个体的血液以确定组织占健康、正常个体的无细胞RNA转录组的相对RNA比重。构成正常RNA转录组的各个组织的相对RNA比重为组织的参考含量。

[0049] 根据某些实施例，可对未知血液样品进行图7中所概述的方法来确定占样品的无细胞RNA转录组的相对组织比重。随后比较样品的相对组织比重与对参考无细胞RNA转录组的相对比重的一或多个参考含量。如果特异性组织占样品中的无细胞RNA转录组的比重显示为大于或小于参考无细胞RNA转录组中的特异性组织的比重，则可相应表征展现差异性比重的所述组织。如果参考无细胞转录组代表健康群体，可将在样品无细胞转录组中展现差异性RNA比重的组织归类为不健康的。[0050] 生物样品可为血液、唾液、痰液、尿液、精液、经阴道体液、脑脊髓液、汗液、母乳、乳房体液(例如乳房乳头吸液)、粪便、细胞或组织活检。在某些实施例中，在多个不同时间点获得相同生物样品的样品以便分析随时间推移生物样品中的差异性转录物含量。例如，可在每个妊娠期中分析母体血浆。在一些实施例中，生物样品为抽取的血液和循环核酸，例如无细胞RNA。在血液或血浆中而不是在细胞中发现可能来自不同基因组来源的无细胞RNA。在一个特定实施例中，抽取的血液为母体血液。为了获得充分量的用于测试的核

酸，优选抽取大致10-50mL的血液。然而，可抽取较少血液用于需要较少统计显著性或RNA样品富集胎儿RNA的基因筛查。

[0052] 本发明的方法涉及从生物样品分离总RNA。可使用此项技术中已知的任何方法从生物样品中分离总RNA。在某些实施例中，从血浆中提取总RNA。血浆RNA提取描述于恩德斯等人,“在子痫前期母体血浆中的循环促皮质素释放的激素mRNA的浓度增加”,临床化学49:727-731,2003(Enders et al.,\"The Concentration of Circulating Corticotropin-releasing Hormone mRNA in Maternal Plasma Is Increased in Preeclampsia,\"Clinical Chemistry49:727-731,2003)中。如此处所描述，使在离心步骤之后采集的血浆与TRIzol LS试剂(英维罗根(Invitrogen))和氯仿混合。离心混合物，且水层转移到新管中。向水层添加乙醇。随后将混合物应用于RNeasy微型柱(凯杰(Qiagen))且根据制造商的建议处理。

[0053] 在生物样品为母体血液的实施例中，可任选地处理母体血液以富集总RNA中的胎儿RNA浓度。例如，在提取之后，可通过凝胶电泳分离RNA且小心地切除含有具有对应于胎儿RNA的尺寸(例如<300bp)的循环RNA的凝胶组分。从此凝胶切片提取RNA且使用此项技术中已知的方法洗提。[00] 或者，可通过已知方法来浓缩胎儿特异性RNA，所述方法包括离心和各种酶抑制剂。使RNA结合到选择性膜(例如二氧化硅)以使其与污染物分离。RNA优选富集在血浆中循环的小于300bp的片段。在RNA尺寸分离介质(例如电泳凝胶或色谱材料)上进行此尺寸选择。

[0051]

流式细胞技术亦可用于富集母体血液中的胎儿细胞(赫岑伯格等人,美国国

家科学院院刊76:1453-1455(1979)(Herzenberg et al,PNAS76:1453-1455(1979))；

[0055]

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毕昂奇等人,美国国家科学院院刊87:3279-3283(1990)(Bianchi et al,PNAS87:3279-3283(1990))；布鲁赫等人,产前诊断11:787-798(1991)(Bruch et al,Prenatal Diagnosis11:787-798(1991)))。美国专利第5,432,0号也描述使用由聚乙烯制成的具有宽顶部和狭窄、毛细管底部的管子的分离胎儿成核红血球的技术。使用变速程序的离心在毛细管中产生基于分子的密度的红血球的堆叠。回收含有低密度红血球(包括胎儿红血球)的密度部分且随后有差异地溶血以优选地破坏母体红血球。高渗介质中的密度梯度用于从淋巴细胞和破裂母体细胞中分离现富集胎儿红血球的红血球。高渗溶液的使用使红血球收缩，增加所述红血球的密度且有助于从更密集的淋巴细胞中纯化。在已分离胎儿细胞之后，可使用此项技术中的标准技术来纯化胎儿RNA。[0056] 此外，可向母体血液添加稳定细胞膜的试剂以减少母体细胞溶解，所述试剂包括(但不限于)醛、尿素甲醛、酚甲醛、DMAE(二甲基氨基乙醇)、胆固醇、胆固醇衍生物、高浓度的镁、维生素E和维生素E衍生物、钙、葡糖酸钙、牛磺酸、烟酸、羟胺衍生物、氯吡哌醇(bimoclomol)、蔗糖、虾青素、葡萄糖、阿米替林(amitriptyline)、异构体A藿烷四苯乙酸酯、异构体B藿烷四苯乙酸酯、胞磷胆碱、肌醇、维生素B、维生素B复合物、胆固醇半丁二酸酯、山梨糖醇、钙、辅酶Q、泛醌、维生素K、维生素K复合物、甲基萘醌、唑尼沙胺(zonegran)、锌、银杏叶提取物、二苯乙内酰脲、泊夫特兰(perftoran)、聚乙烯吡咯烷酮、磷脂酰丝氨酸、得理多(tegretol)、PABA、色甘酸二钠、奈多罗米钠(nedocromil sodium)、苯妥英(phenyloin)、柠檬酸锌、脉舒律(mexitil)、狄兰汀(dilantin)、玻尿酸钠或泊咯沙姆(polaxamer)188。

[0057] 使用此试剂的方案的实例如下：在4℃下储存血液直到处理。在将制动功率设定在零的情况下在离心机中以1000转/分旋转管子十分钟。以1000转/分再次旋转管子十分钟。将各个样品的上清液(血浆)转移到新管子中且在将制动器设定在零的情况下以3000转/分旋转十分钟。将上清液转移到新管子中且在-80℃下储存。将大致两毫升含有母体细胞的“白细胞层”置放到单独的管子中且在-80℃下储存。[0058] 本发明的方法还涉及从总RNA制备扩增的cDNA。制备cDNA且在不稀释分离的RNA样品或将分离的RNA中的基因材料的混合物分散到离散反应样品中的情况下无差别地扩增cDNA。优选地，在3'端处开始扩增以及随机贯穿样品中的整个转录组中以得到mRNA和非聚腺苷酸化转录物两者的扩增。由此最优化双链cDNA扩增产物以产生用于下一代测序平台的测序库。根据本发明的方法适用于扩增cDNA的试剂盒包括例如奥伟森

RNA测序系统。

[0059] 本发明的方法还涉及对扩增的cDNA进行测序。尽管任何已知测序方法可用以对扩增的cDNA混合物进行测序，但是单个分子测序方法为优选的。优选地，通过全转录组鸟法测序(在此也被称为“RNA测序”)对扩增的cDNA进行测序。可使用多种下一代测序平台(例如伊路米那(Illumina)基因组分析仪平台、ABI SOLiD测序平台或生命科学4(Life Science's4)测序平台)来实现全转录组鸟法测序(RNA测序)。

[0060] 本发明的方法进一步涉及对cDNA进行数字计数和分析。可借助序列读数(每一扩增链一个读数)定量扩增样品中的各个转录物的扩增序列的数目。不同于前述数字分析方法，测序允许在单核苷酸水平下检测和定量存在于含有来自不同基因组来源的基因材料从而有多个转录组的生物样品中的各个转录物。

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在数字计数之后，可比较各种扩增转录物的比率以确定生物样品中的差异性转录物的相对量。当在不同时间点获得多个生物样品时，随着时间的推移可表征差异性转录物含量。

[0062] 还可以使用借助微阵列技术来分析生物样品内的差异性转录物含量。扩增的cDNA可用以探测含有与一种或病状或疾病(例如任何产前病状或任何类型的癌症、发炎或自体免疫疾病)关联的基因转录物的微阵列。

[0063] 应理解可通过计算机程序指令实施本文所披露的方法和任何流程图。可将这些程序指令提供给计算机处理器，从而在处理器上执行的指令形成实施流程图区块中所规定或本文所披露的评估组织的方法中所描述的行动的方式。可通过处理器执行计算机程序指令以使得一系列操作步骤通过处理器进行，从而产生计算机实施的处理。计算机程序指令还可使得至少一些操作步骤同时进行。此外，还可在多于一个处理器上进行一些步骤，例如可在多处理器计算机系统中出现。另外，在不背离本发明的范围或精神的情况下，一或多个处理还可与其他处理同时或甚至以与所说明不同的顺序进行。

[00] 计算机程序指令可储存在任何合适的计算机可读媒体上，所述计算机可读媒体包括(但不限于)RAM、ROM、EEPROM、快闪存储器或其他存储器技术、CD-ROM、数字通用光盘(DVD)或其他光学存储器、盒式磁带、磁带、磁盘存储器或其他磁性存储装置或任何其他可用以存储所需信息且可通过计算装置访问的媒体。

实例

[0066] 实例1：通过RNA测序解析母体血浆无细胞RNA-综合方法[0067] 综述：[0068] 在早期妊娠、中期妊娠、分娩后期间使用微阵列和RNA测序采集5个孕妇的血浆RNA谱以及2个未妊娠女性供体和2个男性供体的血浆RNA谱。[0069] 在这些孕妇中，有两个孕妇患有例如早产的临床并发症且一个孕妇具有双叶胎盘。这些孕妇与正常情况的比较揭示在妊娠的不同时间阶段中展现显著不同的基因表达模式的基因。对与妊娠并发症关联的样品应用这类技术可有助于识别可以用作预测这些病变的分子标记物的转录物。[0070] 研究设计和方法：[0071] 个体

[0072] 在早期妊娠、中期妊娠、晚期妊娠和分娩后期间从5个孕妇采集样品。还从2个非妊娠女性供体和2个男性供体采集血浆样品作为对照。[0073] 血液采集和处理

[0074] 将血液样品采集在EDTA管子中且在4℃下以1600g离心10分钟。将上清液以1mL等分试样置于1.5mL微量离心管中，随后使其在4℃下以16000g离心10分钟以移除剩余细胞。随后在-80℃下将上清液储存在1.5mL微量离心管中直到使用。[0075] RNA提取和扩增

[0076] 通过Trizol LS试剂提取无细胞母体血浆RNA。使用RNA测序奥伟森试剂盒(努根(NuGen))将提取并纯化的总RNA转化成cDNA并扩增。(对于微阵列和RNA测序样品制备，上述步骤相同)。

[0065] [0077]

使用脱氧核糖核酸酶I将cDNA分成片断且使用生物素标识，接着杂交到昂飞

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(Affymetrix)基因芯片ST1.0微阵列。将伊路米那测序平台和标准伊路米那库制备方案用于测序。

[0078] 数据分析：[0079] 微阵列与RNA测序之间的相关性

[0080] 将RMA算法应用于处理原始微阵列数据以便背景校正和归一化。使用RNA测序的CASAVA1.7管线获得已测序转录物的RPKM值。将RNA测序中的RPKM和微阵列中的探测强度转化成log2标度。对于RNA测序数据，为避免采用0的对数，在采用对数之前将RPKM为0的基因表达设定成0.01。随后计算这两个平台范围之间的相关系数。[0081] 使用RNA测序的RNA转录物含量的差异性表达[0082] 使用edgeR，即一组特定编写以分析数字基因表达数据的库函数进行差异性基因表达分析。随后使用DAVID进行基因本体(Gene Ontology)以识别显著富集的GO项。[0083] 主成分分析和显著随时间变化的基因的识别[0084] 使用R中的自定义脚本进行主成分分析。为了识别随时间变化的基因，将R中的函数的时程库用于实施经验贝叶斯(Bayes)方法以便评估涉及时程的实验中的差异性表达，在我们的情形下时程为各个别患者的不同的妊娠期和分娩后。

结果与讨论[0086] RNA测序揭示妊娠相关联的转录物被检测到在妊娠与非妊娠个体之间含量显著不同。

[0087] 在妊娠与非妊娠个体之间使用RNA测序和基因本体(Gene Ontology)分析得出的转录物含量的比较揭示展现差异性转录物含量的转录物显著与女性妊娠关联，表明RNA测序能够实现因妊娠所致的这两个种类的转录组之间的真实差异的观测。最高分级显著表达基因为PLAC4，也作为用于研发基于RNA的第21对染色体三体症测试的先前研究中的目标而被知晓。最先检测到的女性妊娠相关联的差异性表达的转录物的列表显示在图1中。[0088] 对母体血浆中的血浆细胞无RNA转录物含量的主成分分析(PCA)区分早产与正常妊娠

[00] 使用血浆无细胞转录物含量谱作为主成分分析的输入，将各个患者在不同时间点的谱聚类到不同病理性群集中，表明母体血浆中的无细胞血浆RNA转录物谱可用以区分早产和非早产妊娠。

[0090] 使用微阵列和RNA测序两者来定量血浆细胞无RNA含量。来自各个患者根据微阵列和RNA测序的转录物表达含量谱为相关的，具有大致0.7的皮尔逊(Pearson)相关系数。无细胞RNA转录物含量的两个主要主成分的曲线显示在图2中。

[0091] 母体血浆中的无细胞RNA转录物的识别展现在全部三个妊娠期和分娩后在早产与正常妊娠之间显著不同的随时间变化的趋势

[0092] 使用微阵列在早产及正常妊娠中展现不同时间含量的前100种无细胞转录物含量的热图显示在图3A中。使用RNA测序在早产及正常妊娠中展现不同时间含量的前100种无细胞转录物含量的热图显示在图3B中。

[0085]

在全部三个妊娠期和分娩后在早产与正常妊娠之间展现显著不同的随时间变化

的趋势的通过微阵列和RNA测序识别的常见无细胞RNA转录物

[0094] 在早产与正常妊娠之间差异性表达的前20种转录物的排列显示在图4中。使用

[0093]

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基因本体来分析这些前20种常见RNA转录物且其显示为富集连接(整合或松散地结合)到质膜或在血小板膜上的蛋白质(参看图5)。[0095] PVALB的基因表达谱

[0096] 由PVALB基因编码的蛋白质为在结构上和功能上类似于调钙蛋白和肌钙蛋白C的高亲和力钙离子结合蛋白。所编码的蛋白质被认为与肌肉松弛有关。如图6中所示，在不同妊娠期中PVALB的基因表达谱显示相比于正常妊娠发现早产[以蓝色突出]具有较高的无细胞RNA转录物含量。[0097] 结论：[0098] 来自使用RNA测序定量和表征母体血浆无细胞RNA的结果强烈表明可检测到妊娠相关联的转录物。[0099] 此外，RNA测序和微阵列方法均可检测可观的基因转录物，所述基因转录物的含量显示具有与早产关联的高机率的差异性时间趋势。

[0100] 可修改在此所描述的方法以研究不同病理性情形的孕妇且还可以修改所述方法以研究在更频繁的时间点的时间变化。[0101] 实例2：在妊娠期间展现时间变化的组织特异性无细胞RNA的定量综述：[0103] 已广泛采用在母体血浆中发现的无细胞胎儿DNA用于非侵入性诊断。相比之下，已显示在母体循环中以类似方式检测的无细胞胎儿RNA已作为诊断形式而被广泛应用。胎儿无细胞RNA和DNA均面临类似的区分胎儿组份与母体组份的挑战，因为在两种情况下母体组份均占优势。为了检测胎儿来源的无细胞RNA，可专注于仅在胎儿发育期间高度表达的基因，所述基因随后推断为胎儿来源且易于与背景母体RNA区分。此类观点通过已确定在妊娠期间来源于在胎盘中高度表达的基因的无细胞胎儿RNA可在母体血浆中检测的研究来协作。

[0104] 使RNA与DNA分离的显著特征可归因于在胎儿发育期间充分反映的RNA转录物动态性质。生命以由授精而形成单细胞受精卵开始且由具有相异组织类型的多细胞生物体结束的一系列精心设计的事件开始。在妊娠期间，大部分胎儿组织经历大范围的重构且含有功能上相异的细胞类型。此潜在相异性可作为来自相同细胞核谱系的差异性基因表达的结果产生；尽管不同细胞类型的基因组相同，RNA转录物的量决定不同细胞类型制造不同量的蛋白质。人类基因组包括大致30,000个基因。在特定分化的细胞类型内仅较小组的基因转录为RNA。已经通过许多涉及经典动物模型的发育胎儿的研究和数据库来识别这些组织特异性RNA转录物。将可获得的已知文献与借助测序而由样品产生的高处理量数据组合，可表征母体血浆内所含有的RNA转录物的整个集合。

[0105] 在妊娠期间胎儿器官形成取决于基因表达的连续程序。RNA量的时间调节对于产生伴随胎儿器官起源的细胞分化现象的此进展为必需的。为了阐明无细胞RNA的类似时间动态，将母体血浆无细胞RNA的表达图谱(尤其所选的一组胎儿组织特异性基因)作为在妊娠和分娩后期间的全部三个妊娠期中的函数来分析。利用高处理量定量聚合酶链反应和测序技术能力用于无细胞胎儿组织特异性RNA转录物的同时定量，获得母体血浆中胎儿来源的RNA转录物的光谱的系统含量视图。另外，分析母体血浆从而以不同胎儿组织类型的相对比例解卷积胎儿来源的异质无细胞转录组。考虑母体血浆中的胎儿比重此方法并有生

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理，具体来说要求各个胎儿组织的比重的百分率为非负的且在妊娠的全部三个妊娠期期间总和为一。这些数据集上的使结果能够解释为来自不同胎儿器官的相对比例。也就是说，先前选定的展现时间变化的胎儿组织特异性RNA转录物的图表可以用作应用二次规划以便确定一或多个样品中的相关组织特异性RNA比重的基础。[0106] 在分别考虑时，母体血浆内的这些胎儿组织特异性转录物中的每一个的定量可以用作在妊娠期间所述特定胎儿组织的凋亡速率的测量。通过细胞和凋亡细胞死亡来严格正常胎儿器官发育。发育组织竞争存活和激增，且器官尺寸为细胞增殖与死亡之间的平衡的产物。由于异常细胞死亡与发育疾病之间的紧密关联，凋亡的治疗性调变已变为密集研究的领域，但随着这个带来对于监测特定的凋亡速率的需求。胎儿无细胞RNA转录物的定量提供这类预测值，尤其在早产中，其中这些早产婴儿的各个器官的凋亡发生率已显示造成早产婴儿的神经发育性缺陷和大脑性麻痹。[0107] 样品采集和研究设计[0108] 胎儿组织特异性转录物图表的选择

[0109] 为了检测这些胎儿组织特异性转录物的存在，根据已知文献和数据库制备已知胎儿组织特异性基因的列表。通过在两个主要数据库之间交叉引用来证实胎儿组织的特异性：TISGeD(肖,S.-J.,张,C.和季,Z.-L.TiSGeD:组织特异性基因的数据库.生物信息学(牛津,英格兰)26,1273-1275(2010))(Xiao,S.-J.,Zhang,C.&Ji,Z.-L.TiSGeD:a Database for Tissue-Specific Genes.Bioinformatics(Oxford,England)26,1273-1275(2010)))和BioGPS(吴,C.等.BioGPS:查询和组织基因注释来源的可扩展和可定制门户.基因组生物学10,R130(2009)(Wu,C.et al.BioGPS:an extensible and customizable portal for querying and organizing gene annotation resources.Genome biology10,R130(2009))；苏,A.I.等.小鼠和人类蛋白质编码转录组的基因.美国国家科学院院刊101,6062-7(2004))(Su,A.I.et al.A gene atlas of the mouse and human protein-encoding transcriptomes.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America101,6062-7(2004)))。这些选定的转录物的大部分与已知胎儿发育过程关联。基因的此列表与RNA测序和微阵列数据重叠以产生显示在图8中的选定胎儿组织特异性转录物的图表。[0110] 个体

[0111] 在早期妊娠、中期妊娠、晚期妊娠和分娩后期间从正常孕妇采集母体血液的样品。对于阳性对照，从安捷伦(Agilent)购买来自各个胎儿组织类型的胎儿组织特异性RNA。通过用水以及用未经历反转录处理的样品整体处理进行所述实验的阴性对照。

血液采集和处理

[0113] 在各个时间点，从各个个体抽取7mL到15mL的外周血液。以1600g离心血液10分钟且转移到微量离心机管子中以便以16000g进一步离心10分钟从而移除剩余细胞。在血液抽取的24小时内进行上述步骤。在-80摄氏度下储存所得血浆用于后续RNA提取。[0114] RNA提取

[0115] 使用Trizol接着凯杰的RNeasy微型试剂盒来承载无细胞RNA提取物。为了确保没有污染DNA，在使用来自凯杰的无核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶洗提RNA之后进行脱氧核糖核酸酶分解。随后使用标准微阵列和伊路米那RNA测序方案处理所得的来自妊娠个体

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的无细胞RNA。这些步骤产生我们用于产生RNA测序数据以及微阵列表达数据的测序库。随后将其余无细胞RNA用于平行定量聚合酶链反应。[0116] 选定转录物的平行定量聚合酶链反应

[0117] 使用富鲁达生物标记(Fluidigm BioMark)系统进行这些胎儿组织特异性转录物的准确定量(参看例如司布真,S.L.,琼斯,R.C.和拉马克里希南,R.使用微流体动态阵列中的实时聚合酶链反应(PCR)的高处理量基因表达测量.公共科学图书馆·综合3,el662(2008)(Spurgeon,S.L.,Jones,R.C.&Ramakrishnan,R.High throughput gene expression measurement with real time PCR in a microfluidic dynamic array.PloS one3,el662(2008)))。此系统允许胎儿组织特异性转录物的图表的同时查询。使用材料的不同起始来源进行询问的两个平行形式。一个使用来自伊路米那测序方案的cDNA库而另一个直接使用洗提RNA。使用靶向所关注的基因的EvaGreen引物扩增材料的两种来源。两种来源RNA和cDNA均经预扩增。使用EvaGreen聚合酶链反应超混合液和引物预扩增cDNA。使用来自英维罗根的CellsDirect一步定量实时-聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒预扩增RNA来源。对默认一步定量实时-聚合酶链反应方案进行修改以供应较长的反转录培育时间。为两种来源进行19次预扩增循环且使用核酸外切酶I处理清除采集的聚合酶链反应产物。为了增加定量随后的定量聚合酶链反应步骤的效率的动态范围和能力，由5倍、10倍和10倍稀释对聚合酶链反应产物进行连续稀释。在所述时间点从个别孕妇采集的母体血浆中的每一个经历相同程序且装载到来自富鲁达(Fluidigm)的48×48动态阵列芯片上以进行定量聚合酶链反应。对于阳性对照，从安捷伦购买来自各个胎儿组织类型的胎儿组织特异性RNA。这些来自胎儿组织的RNA中的每一个经历相同预扩增和清除步骤。同样产生具有相同的不同胎儿组织比例的合并样品用于随后的分析从而解卷积合并样品中的各个组织类型的相对比重。使用富鲁达实时聚合酶链反应分析软件预处理来自富鲁达生物标记(Fluidigm BioMark)系统的全部采集数据以获得全部样品中的转录物中的每一个的对应Ct值。通过用水以及用未经历反转录处理的样品整体处理进行所述实验的阴性对照。[0118] 数据分析：[0119] 在出生之后的较短时间段内从母体周边血流清除胎儿组织特异性RNA转录物。也就是说，母体血液的分娩后无细胞RNA转录组不具有胎儿组织特异性RNA转录物。因此，预期这些胎儿组织特异性转录物的量在出生之前高于出生之后。所关注的数据为在妊娠的全部三个妊娠期中与婴儿出生之后的此基线含量相比较组织特异性转录物的相对定量变化。如方法所描述，同时均使用有效无细胞RNA以及相同无细胞RNA的cDNA库来定量胎儿组织特异性转录物。所获得的原始数据的实例显示在图9A和图9B中。使用无细胞RNA作为初始来源的定量聚合酶链反应系统得到较好品质的读数。以来自直接无细胞RNA来源的定量聚合酶链反应结果为重点，通过使用分娩后的含量作为比较基线比较在全部三个妊娠期中这些胎儿组织特异性转录物中的每一个的倍数变化含量来进行分析。采用Δ-ΔCt方法(施米特根,T.D.和利瓦克,K.J.通过比较CT方法分析实时聚合酶链反应数据.自然实验手册3,1101-1108(2008)(Schmittgen,T.D.&Livak,K.J.Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.Nature Protocols3,1101-1108(2008)))。转录物表达含量中的每一个与管家基因相比较以得到ΔCt值。随后，为了比较各个妊娠期出生之后，使用分娩后数据作为基线来应用Δ-ΔCt方法。

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结果和论述：[0121] 如图10、11和12中所示，与出生之后相比较在所述妊娠期期间大体上发现组织特异性转录物处于较高含量。确切地说，胎盘、胎儿大脑和胎儿肝脏特异性转录物的组织特异性图表显示相同偏差，其中通常发现在妊娠期间这些转录物以相较于出生之后更高的含量存在。在不同妊娠期之间，大体趋势显示这些转录物的量随着妊娠的进展增加。[0122] 定量胎儿组织特异性RNA的生物显著性：图表中的大部分转录物与胎儿器官发育有关且也在羊水内发现许多。一次这类实例为ZNF238。此转录物对胎儿大脑组织具有特异性且已知在形成神经元层时在胚胎发生期间所述转录物对于大脑皮质扩张至关重要。在中枢神经系统中ZNF238的缺失引起神经形成的严重破坏，产生显著的产后较小大脑表型。使用本发明的方法，可根据发育阶段确定ZNF238是否以健康、正常的含量存在。[0123] 已知的因ZNF238的缺失所致的缺陷包括显著的产后较小大脑表型：小头畸形、胼胝体的发育不全和小脑发育不全。

[0124] 有时在出生之前通过产前超声波可诊断小头畸形。然而，在许多情况下通过超声波并不明显直到晚期妊娠。通常，在出生或随后的婴儿期之前未进行诊断知道发现宝宝的头围比正常的小得多。小头畸形为终身病状且目前不可治疗。伴随小头畸形出生的儿童将需要医生频繁的检查和诊断性测试以在他或她生长时监测头部的发育。使用本发明的方法的ZNf238差异性表达的早期检测提供产前诊断且在治疗过程期间可控制药物治疗和投药的预测值。

除ZNF238以外，许多经表征转录物可控制涉及凋亡的发育疾病(即由在神经发育

期间不必要神经元的移除引起的疾病)中的诊断性值。鉴于在发育期间神经元的凋亡为基本的，可推知在神经退行性疾病(例如阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病和肌肉萎缩性侧索硬化)中可激活类似凋亡。在此类情境中，在此所描述的方法将提供对于疾病进展的紧密监测和可能根据进展提供理想剂量。

[0126] 推断不同胎儿组织类型的相对比重：特异性组织的凋亡的差异性速率可与某些发育疾病直接相关。也就是说，某些发育疾病可增加在母体转录组中观察到的具体特异性RNA转录物的含量。来自各个组织类型的相对比重的知识将实现这些疾病的进展期间的变化的这些类型的观测。妊娠期间的胎儿组织特异性转录物的定量图表可被视为来自各个胎儿组织的比重的总和。[0127] 表达，

[0125] [0128]

其中Y为观察到的母体血浆中的对于基因i的转录物量，X为已知胎儿组织j中

的对于基因i的已知转录物量而ε为正态分布误差。其它生理包括：[0130] 1.占所观测的定量的比重的全部百分率的总和为1，通过以下条件指定：Σπi＝1

[0131] 2.来自各个组织类型的全部比重必须大于或等于零。具有负的比重没有物理意义。此通过πi≥0指定，因为π定义为各个组织类型的百分率比重。[0132] 因此为了获得各个组织类型最优百分率比重，使最小平方差减到最小。随后使用R中的二次规划解析上述等式以获得所述组织类型与母体无细胞RNA转录物的最优相对比

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重。在工作流程中，就获自定量聚合酶链反应的Ct值来说相对于管家基因指定RNA转录物的量。因此，Ct值可被视为所测量的转录物量的代表。Ct值的增加为一类似于转录物量的两倍变化，即2的1次幂。所述处理伴以相对于管家基因归一化CT中的全部数据，接着二次规划。

[0133] 以相等比例混合不同胎儿组织类型(大脑、胎盘、肝脏、胸腺、肺脏)以产生合并样品作为上述流程图的概念的证据。使用相同富鲁达生物标记系统定量各个胎儿组织类型(大脑、胎盘、肝脏、胸腺、肺脏)连同合并样品以从全部组织和合并样品中的各个胎儿组织特异性转录物的定量聚合酶链反应获得Ct值。这些值用于进行相同解卷积。胎儿组织器官(大脑、胎盘、肝脏、胸腺、肺脏)中的每一个的所得胎儿百分率分别为0.109、0.206、0.236、0.202和0.245。[0134] 结论：[0135] 综上所述，胎儿特异性无细胞转录物的图表一次提供遍及不同胎儿组织的宝贵的生物信息。最确切地说，所述方法可推断胎儿组织特异性转录物比总RNA的不同相对比例，以及在单独考虑时，各个转录物可指示胎儿组织的凋亡速率。这类测量具有用于发育和胎儿药物的诸多可能应用。大部分人类胎儿发育研究已主要依赖于产后组织样本或夭折的胎儿。在此所描述的方法提供在对妊娠妈妈和胎儿具有极小风险的情况下存活胎儿上胎儿组织/器官生长或死亡的速率的快速和迅速分析。可采用类似方法以监测展现血浆中的特异性无细胞RNA转录物的主要成年器官组织系统。

实例3：成年无细胞转录组的解卷积[0137] 综述：[0138] 分析4个健康、正常成人的血浆RNA特征。基于不同组织类型的基因表达特征，所描述的方法定量各个组织类型占供体的血浆中的无细胞RNA组份的相对比重。为了定量，采用来自不同组织类型的凋亡细胞以释放其RNA到血浆中。这些组织中的每一个表达特定数目的对所述组织类型独特的基因，且观察到的无细胞RNA转录组为这些不同组织类型的总和。

[0139] 研究设计和方法：[0140] 为了确定组织特异性转录物占无细胞成年转录组的比重，根据已知文献和数据库制备已知组织特异性基因的列表。利用两个数据库来源：人类U133A/GNF1H基因阿特拉斯和RNA测序阿特拉斯。使用来自这两个数据库的原始数据，通过以下方法识别组织特异性基因。将模板匹配处理应用于获自所述两个数据库的数据以便识别组织特异性基因。通过所述方法识别的组织特异性基因的列表提供在图18中。通过数据库中的组织样品的数目图表的特异性和灵敏度。例如，人类U133A/GNF1H基因阿特拉斯数据集包括84个不同组织样品，且通过84个样品集来自所述数据库的图表的特异性。类似地，对于RNA测序阿特拉斯，存在11个不同组织样品且特异性限于区分这11个组织。在获得来自两个数据库的组织特异性转录物的列表之后，用文献以及组织特异基因数据库(TisGED)来校验这些转录物的特异性。

[0136]

成年无细胞转录组可被视为获自两个数据库的组织特异性转录物的总和。为了定

量地推断成年无细胞转录组中的不同组织的相对比例，进行二次规划作为最优化方法以推断不同器官/组织占无细胞转录组的相对最优比重。此处理的特异性和准确度视图X

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中提供的基因表和在RNA测序和微阵列中可检测的程度而定。[0142] 个体：从4个健康、正常成人采集血浆样品。[0143] 初始结果：[0144] 使用上述揭示不同组织和器官的相对比重的方法的来自微阵列的我们的成年无细胞RNA转录组的解卷积列表在图13中。

图13显示在全部4个个体中成人的正常无细胞转录组为一致的。4个个体之间

的相对比重并不非常不同，表明在正常成人之间来自不同组织类型的相对比重为相对稳定的。从84个可获得的组织类型当中，推断的最优主要起作用的组织来自全血和骨髓。[0146] 所关注的有助于循环RNA的组织类型为下丘脑。通过缺乏有效血液大脑障壁的特定大脑区域形成下丘脑的边界；处于这些部位的毛细血管内皮为网状的以得到平均较大蛋白质和其它分子的自由路径，在我们的情形中我们相信可使来自所述区域中的凋亡细胞的RNA转录物释放到血浆无细胞RNA组份中。[0147] 使用RNA测序对个体进行相同方法。由于可获得的组织特异性RNA测序数据的量，所以在此所描述的结果为受限的。然而，应理解组织特异性数据随着各个组织比率的测序的逐渐增加比率扩大，且未来的分析将能够利用那些资料集。对于RNA测序数据(与微阵列相比较)，全血或骨髓样品均未获得。仅可将无细胞转录组分解成可获得的RNA测序数据的11个不同组织类型。其中，仅观察到来自下丘脑和脾脏的相对比重，如图14中所示。[0148] 进一步选定94个组织特异性基因的列表(如图15中所示)用于使用定量聚合酶链反应校验。使用富鲁达生物标记平台对来源于以下组织的RNA进行定量聚合酶链反应：大脑、小脑、心脏、肾脏、肝脏和皮肤。将类似定量聚合酶链反应工作流程同样应用于无细胞RNA组份。通过与管家基因比较得到的ΔCt值：以图16中的热图形式绘制ACTB，其显示在无细胞RNA中这些组织特异性转录物为可检测的。[0149] 以引用的方式并入[0150] 本发明全文曾参考和引用其它文献，例如专利、专利申请案、专利公开案、杂志、书籍、论文、网站等。所有这些文献都通过全文引用并入在此用于所有目的。[0151] 等效物[0152] 在不背离本发明的精神或基本特性的情况下，可以其它特定形式实施本发明。因而，在所有方面都应认为前述实施例是对在此描述的发明的说明，而非。因此，本发明的范围是由所附权利要求书而不是前述实施方式指示，且因而打算将在权利要求书的等效内容的含义和范围内的所有变化都包括在本发明中。

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