酶促反应动力学实验

实验（一）一一碱性磷酸酶值测定

【目要求】

1. 了解底物浓度对酶促反应速度影响

2. 了解米氏方程、值物理意义及双倒数作图求值方法。

【实验原理】

1、 碱性磷酸酶：

碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其屮以肝脏为最 多。其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一酶，而 是一组同功酶。本实验用碱性磷酸酶是从大肠杆菌屮提取。

2、 米氏方程：

在研究底物浓度及酶促反应速度定量关系时，导出了酶促反应 动力学基本公式，即：

（1）

式屮：v表示酶促反应速度，

4\"表示酶促反应最大速度， [S]表示底物浓度，

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心表示米氏常数。

3、 心值测定主要采用图解法，有以下四种：

① 双曲线作图法（图1-1, a）

根据公式（1）,以V对［s］作图，此时1/2心“时底物浓度［s］值即 为值，以克分子浓度（M）表示。这种方法实际上很少采用，因 为在实验条件下底物浓度很难使酶达到饱和。实测％^是一个近似 值，因而1/2$住不精确。此外由于v对［S］关系呈双曲线，实验 数据要求较多，且不易绘制。

② 作图法双倒数作图法（图1-1, b）

实际工作中，常将米氏方程（式（1））作数学变换，使之成为直 线形式，测定要方便、精确得多。其屮之一即取（1）式倒数， 变换为方程式：

i二臥十1

v

| 1

Umax ⑸ Umax

（2）

以护勺京作图，即为形式。此时斜率为铤，纵截距为总。把直线 外推及横轴相交，其截距相交，其截距即为一十。

③ 作图法（略） 把（2）式等号两边乘以，得：

2/15

V = 一际水占+ Vmax

以v对占作图，这时斜率为-心，纵截距为S，横截距为。 ④ 作图法（略）

把（2）式等号两边乘以［S］,得：

⑶

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以口对［s］作图，这时斜率为宀 纵截距为严。

V max

v

-max

a

(b)

)

本实验主要以双倒数法，即作图法来测定碱性磷酸酶值。具体

原理如下：

本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸 酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下(10.0,和

60°C),准确反应13分钟。在碱性条件下酚可及酚试剂生成蓝色

化合物，以波长620比色。在一定条件下色泽深浅及光密度成正

噺试剂〔磷钳钩酸〉一一-蓝色化合物｝

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然后以光密度直接表示不同底物浓度时酶反应速度，即以光密度 倒数作纵坐标，以底物浓度倒数作横坐标，按作图法来测定碱 性磷酸酶值。 【仪器及试剂】 仪器：

1•恒温水浴

2. 721型分光光度计

试剂：

1. 酚试剂：称令乌酸钠（“亦血・2禺0） 100g,钳酸钠（血血吃弘。） 25g置1500磨口回流装置内，加蒸憎水700, 85%磷酸50和 浓硫酸100。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h （烧 瓶内加小玻璃

珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（4） 150g,蒸馅水50及液澳数滴。在通风橱中开口煮沸15,以除 去多余澳。冷却后定容至

1000,过滤即成，此液应为鲜黄色, 不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰

箱长期保存。若此贮存液 使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液漠，煮沸几分钟，恢 复原色仍可继续使用。使用时用蒸馆水稀释一倍，最后酸度 为INo

2. 2. 5磷酸苯二钠基质液:称取625磷酸苯二钠（C6H2・2H2O）,

溶于1,000容量瓶屮，加蒸馅水稀释至刻度，加数滴夜漠以 防腐，置冰箱内可保存一年之久。

3. 碱性缓冲液（10.0）：称取无水碳酸钠6. 36g及碳酸氢钠

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3. 36g,溶解于蒸馆水中，并稀释至1,000.

4. 碱性磷酸酶液：称取碱性磷酸酶1,加水3'4,冰箱内可保存

五周左右。 【实验步骤】

取6支试管按下表加入试剂:

1 2.5磷酸苯二钠 （） 0.2 0.8 1.0 2 0.4 0.6 3 0.6 0.4 4 0.8 0.2 5 1.0 - 1.0 6 1.0 0.1 1.0 蒸镭水（） 碱性缓冲液（） 1.0 1.0 1.0 混匀后，6O°C欲温5分钟 - 碱性磷酸酶液（） 0」 0」 0」 0.1 0.1 混匀后，60°C水浴13分钟（准确计时） 注意：1）加入碱性磷酸酶液要快速、准确。用移液加 2）此时为酶促反应，总体积2.1 3）第八管不加酶。 酚试剂（） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1023() 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 混匀后，室温放置15分钟 注意：1）酚试剂为显色剂，同时为酶变性剂，故加入酚试 剂后酶促反应即停止。 2） 23提供碱性环境，加入23后试剂才显色 以6管为调零点，在620波长处比色。 【结果处理】

1将各管光密度和底物浓度记入下表

管号 1 1 |S| 1/[S] 2 3 4 5 2以1为纵坐标，l/[s]为横坐标，按作图，求出碱性磷酸酶值。

【注意事项】

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1） 加入碱性磷酸酶量要准确 2） 保温时间要准确

准确保温方法：从第一管加入酶液开始计时，每隔1分钟向下 一只试管加酶液，直至加完，到准确13分钟立即向第一管加酚试 剂，以终止其反应，并每隔1分钟向下一只试管加酚试剂，直至 加完止，这样保证每管准确保温13分钟。 【思考题】

1） 意义及其影响因子

2） 为什么酶促反应速度以初速度表示 3） 为什么可直接代替V作图 4） 分析自己实验数据

实验（二）一一温度对酶活性影响

【实验目】

了解温度对酶活性及酶促反应速度影响，加深对酶特性认识。 【实验原理】

每种酶都有其最适温度，高于或低于此温度酶活性都降低。一 般而言，若酶处于过高温度环境屮，会使酶活性永久丧失；而若 处于极低温度环境屮只会使酶活性受到抑制，一旦温度适宜，酶 又会全部或部分恢复其活性。 【仪器及试剂】

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仪器：

1.

水浴锅 管和试管架

冰箱

2.恒温

3.试

4.

及头 头滴管

吸量管及吸量管架

5.移液

6.胶

7.烧杯

试剂：

1. 6. 8缓冲液:量取15. 450. 2M磷酸氢二钠和4. 55柠檬酸混 合摇

匀即可。

2. 0.5%淀粉0.5%氯化钠溶液：0. 5g可溶性淀粉和0. 5g氯化 钠，

溶于100蒸憎水(需加热)。

3. 0. 03175 碘液 4. 1M溶液

唾液 【实验步骤】

5. 1M溶液 6.稀释100倍

7.冰水浴

1. 制管和预温

由于本实验对恒温反应要求较高，故每个温度梯度使用两支 试管，分别标记为A管和B管，同时欲温底物及酶。A管加入6. 8 缓冲液和0.

5%淀粉液；B管使用移液加入稀释100倍唾液，相 对应两支试管置

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于设定温度下预温5o

取12支洁净试管，参照下表加入试剂：

1 (0°C) 2(室温)3(37°C) I 4(50°C) 5(70°C) 6(室温) 6. 8缓冲 液（） A 含 0. 5% 淀粉液 （） 稀释100 B 倍唾液 （） 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 用2蒸 镭水代 替 1 1 1 1 1 1 *6号管为对照组（比色时作为0号管），置于室温，且淀

粉液用蒸憎水代替

2. 混合A、B管

将1号A管试剂迅速加入温度对应B管中（为了最大限度保 证酶量），此时为计时起点（使用秒表），摇匀后放回对应温度继 续水浴。注意：转移A管试剂前需将其摇匀。

3 .时间控制

然后每隔1或2 （时间自定）按上步操作依次把2、3、4、5、 6号A、B管混合,严格控制好时间。

4. 中止反应

准确反应13,向1号管加入2滴1M溶液，立即混匀，屮止 反应，按上一步顺序和时间间隔依次对各管进行操作，并移至试 管架。后再各用2滴1M溶液中和每管。

5. 显色

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在每管屮各加入2 0.03175碘液并混匀，观察现彖。

6. 比色

若不同温度梯度间现象差别不明显，则进行比色，通过光密

度值来比较。

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【结果处理】

记录现象（或比较吸光度值），做出合理分析。 【注意事项】

严格注意时间控制及各物质添加量。 【思考题】

如果某同学（没有严格按照教案步骤）做岀实验结果为唾液淀粉 酶最适温度为70度，请分析他得岀这样结果可能原因。

实验（三）一对酶活性影响

【实验目】

了解对酶活性及酶促反应速度影响，加深对酶特性认识。 【实验原理】

1对酶活性影响机理：影响酶活性中心某些必须基团解离，而 这些

基团往往仅在某一解离状态时才最容易同底物结合或具有 最大催化活性；影响可解离基团底物和辅酶荷电状态，从而影响 酶对他们亲和力；还可以影响酶活性屮心空间构象，从而影响酶 活性。

2. 本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受影响情况。淀粉 在该

酶催化作用下会随着时间延长而出现不同程度水解，从而得 到各种糊精乃至麦芽糖，少量葡萄糖等水解产物。碘液及淀粉及 其不同程度水解产物反应呈现不同颜色，即淀粉（蓝色）、紫色糊 精（紫色）、红色糊精（红色）、麦芽糖及少量葡萄糖（黄色）。

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【仪器及试剂】 仪器：

1、冰箱

4、 试管架及试管 5、 移液管架及移液管

试剂：

2、电炉 3、恒温水浴锅

1、 0. 2M磷酸氢二钠溶液：称取35. 61g含2个结晶水磷酸氢 二

钠，用水定容至1L。

2、 0. 1M柠檬酸溶液：称取21.01g含一个结晶水柠檬酸，用 水

定容至lLo

3、 唾液淀粉酶：将唾液分別稀释10倍、50倍和100倍，得 三种

不同浓度酶液、

4、 0. 5%淀粉0. 5%氯化钠溶液:0. 5g可溶性淀粉和0. 5g氯 化

钠，溶于100蒸馅水（需加热）。

5、 0.1%淀粉液：0. lg可溶性淀粉，加到100蒸憎水中，加 热溶

解。

6、 碘液：15g碘化钾和12. 7g碘，加少许水使碘完全溶解后, 再

用水稀释至200。

7、 1%氯化钠溶液。 8^ 0. 1%硫酸铜溶液。

【实验步骤】

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（一）对酶活性影响

1、缓冲溶液配制

取六只洁净三角烧瓶，按表1编号和加试剂： I 制

表1 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配

取六支洁净试管，编号后按表2操作：

表2对酶活性影响

三角烧瓶号 值 0.2M磷酸二氢钠（） 0.1 M柠檬酸（）

1 5.4 11.15 8.85 2 6.2 6.78 3 6.8 4.55 4 7.0 16.47 3.53 5 7.4 18.17 1.83 6 8.0 19.45 0.55 13.22 15.45 管号 值 缓冲液量（） 含0. 5%淀粉（） 1 5.4 3 2 2 6.2 3 2 3 6.8 3 2 4 7.0 3 2 5 7.4 3 2 6 8.0 3 2 2 稀释100倍唾液（） 2 2 2 2 2 充分摇匀，37°C水浴保温，严格控制时间5后，立即向各管加入碘液 碘液（滴）

3 3 3 3 3 3 充分摇匀，观察各管颜色差异 【结果处理】

记录现象（或比较吸光度值），做出合理分析。

【注意事项】

充分摇匀，严格控制时间。

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【思考题】

酶最适值受哪些因素影响?

实验（四）一一酶浓度对酶活性影响

【实验目】

了解酶浓度对酶活性及酶促反应速度影响，加深对酶特性认 识。 【实验原理】

在适宜条件下，若反应物浓度大大高于酶浓度时，反应速度 随酶浓度增加而增加，两者间成正比。但若反应底物浓度较低， 而且酶浓度足够高时，增加酶浓度，反应速度基本不变。

本实验采用唾液淀粉酶为例。加入不同浓度酶，并比较在同 一适当时间后，以碘检验淀粉含量从而确认其反应程度。 【仪器及试剂】

仪器：

1 •恒温水浴锅 2. 吸量管 3. 试管及试管架

试剂：

1. 含

0.5%淀粉液

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2.7. 0缓冲液

3. 分别稀释过10倍、50倍和100倍后唾液

【实验步骤】

1.取3支洁净试管，按下表加入淀粉液，缓冲液，加毕放入 37度恒温水浴锅屮保温5分钟；

2.保温后，快速加入不同浓度稀释唾液，摇匀，立即放入 37度恒

温水浴中，并计时。约3至4分钟后加入等量碘液一至 两滴，立即摇匀后，记录各管颜色。

管号 含0.5%淀粉 液 1 2 3

7.0缓冲液 10倍 稀释唾液 50倍 颜色 100倍 3 3 3 2 1 1 2 2 1 【结果处理】

记录现象，做出合理分析。 【思考题】

实验（五）一一离子对酶活性影响

【实验目】

了解离子对酶活性及酶促反应速度影响，加深对酶特性认识。 【实验原理】

酶活性常常受某些物质影响，有些物质能使酶活性增加，称

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为酶激活剂；有些物质能使酶活性降低，称为酶抑制剂。是唾液 淀粉酶激活剂。其它阴离子，如、「和对该酶也有激活作用，但 较微弱。而旷对唾液淀粉酶具有抑制作用。激活剂和抑制剂影响 酶活性剂量是很少，并且常具有特异性。

就本实验，低浓度可以增加酶活性，高浓度或者低浓度旷则 会抑制酶活性，同时低浓度、广等对酶活性没有影响。激活剂作 用机制是多种多样，可能是作为辅酶或辅基一个组成部分，也可 以直接作为酶活性屮心构成部分。 【仪器及试剂】

仪器：

1 •恒温水浴锅

2.

吸量管 3.

试管及试管架

试剂：

1. 1溶液 2. 0. h溶液 3. 0.1%淀粉液 4. 100倍稀释唾液 5. 碘液

【实验步骤】

取3支洁净试管，编号后按下表操作：

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管号 1() 1 1 2 3 0.14() 1 蒸镭水() 0.1%淀粉液() 3 3 1 3 1 2 100倍稀释唾液() 1 1 37°C恒温水浴15,取出滴加碘液 碘液 结果 2 2 【结果处理】

记录现象(或比较吸光度值)，做出合理分析。 【思考题】

为什么加入淀粉后有试管内颜色显现为红色? (思考题可以总结起来出在最后面)

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