荧光原位杂交FISH实验步骤与方法

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FISH实验步骤

一、 实验仪器：

荧光显微镜：

髙速离心机：可达12000r/min 高压灭菌锅：160°C以上杀菌 恒温箱：为杂交提供恒左温度 恒温水浴锅

照相机（与荧光显微镜配套）：荧光捕捉图片

二、 试剂的配制：

1、 0.2mol/ L （pH7.4）磷酸缓冲溶液（PB）

试剂为 NaHfOo • 2HoO 和 Na：HPO； - 12比0。

--------- 0. 2M 的 NalLPO,溶液：31. 2g NalLPO,・ 2H：0,加蒸馅水 lOOOmL 溶解 --------- 0. 2M的NazHPO,溶液：71. 632g NaJlPO,・12比0加蒸憾水至1000ml溶解

-一-0. 2M （pH7. 4）磷酸缓冲溶液（PB） : 19ml的NaHoPO,溶液和81ml的Na：HPO,溶液充分 混合 高压灭菌，常温保存。

2、 0. 03 mol/ L磷酸盐缓冲溶液（（PBS）

试剂为NaCl和磷酸缓冲溶液PB

---------- 0. 03MPBS溶液：22.8gNaCl , 150ml磷酸缓冲溶液（PB）,加蒸馅水至1000ml, 混匀

---------- 0. 02 MPBS溶液:取100ml 0. 03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馅水稀释至150ml 0. 01 MPBS溶

液：取50ml 0. 03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馅水稀释至150ml 高压灭菌，常温保存。

3、 4%多聚甲醛溶液（1000ml）（在通风橱内进行操作）

---- 将略小于2/3体积的水（660ml）加热到50°C,

------------- 40呂多聚甲醛PFA,边搅拌边加入到水中，继续保持60°C ------------- 1滴2mol/LNaOH溶液,立即澄淸，但仍有小颗粒。 ------------- 1/3体积的PBS溶液，

------ 用氐1将戸11调至7.2,定容, ------ 用孔径为0.22 Pm的滤膜过滤，

一一4°C保存最多保存两天，或者取少量保存在-20aC»

（加热时温度不宜过髙，为60°C-65°C,否则PFA容易降解，配置好后应尽快使用，否 则固定效果较差）。

4、 lmol几（pH8. O）Tris-HCl缓冲液的配置

一-121. lg Tris（三疑基氨基甲烷），加800mL蒸憎水溶解，加入大约42mL的浓HC1 -一用1M的HC1或1M的NaOH将pH调至8. 0,最后加蒸憾水至1000M1 高压灭菌，4°C冰箱保存。

5、 10%SDS

—10g SDS （十二烷基硫酸钠）于50ml火菌水中，加水至100ml,分装后室温保存。火 菌，或用滤膜过

滤

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称取SDS时需戴口罩！

6、 0.5M EDTA （pH8. 0）溶液的配置

一一 186. Ig乙二胺四乙酸二钠加800mL蒸馅水溶解，剧烈搅拌（最好使用磁力搅拌机） ---- 用NaOH调节溶液的pH至& 0,然后定容至lOOOmLo

7、 杂交缓冲液

配置2ml杂交缓冲液于2ml离心管中，各试剂的加入顺序：

360 uL 40 uL x u L y u L 2uL

5M NaCl：

lMTris—HC1

100%甲酰胺（见下表）

无菌水（见下表）

10%SDS

C保存 0. 22 u m孔径的滤膜过滤，4°

表1 配置不同甲酰胺杂交液中甲酰胺和无菌水的体积 甲酰胺体积X （ UL） 无菌水体积y（ uL） 甲酰胺浓度（%） 0 L 0 10 15 20 25 30 35 40 45 50 L L □0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1598 1498 1398 1298 1198 1098 998 8 798 698 598 498 * . J 丁 （甲酰胺有剧毒，操作时需戴手套，在通风处内进行，废液需要回收） 不同甲酰胺杂交液的配制 甲酰胺浓度 （%） 20 35 40 55 5M NaCl溶液 (mL) 72 72 72 72 IM Tris-HCl (mL) 8 8 8 8 10% SDS (mL) 0.4 0.4 0.4 0.4 甲酰胺体积x （mL） 80 140 160 220 无菌水体积y （mL） 239.6 179.6 159.6 99. 6 ] 8、杂交后洗涤液的配置

配制50mL杂交洗涤液于50mL离心管中，各试剂加入的顺序如下:

Z uL 5M NaCl

ImL lMTris-HCl(pH7.6) 无菌水加至50mL 50 nL 10%SDS

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500 u L EDTA

根据杂交缓冲液中甲酰胺浓度而左的探针淸洗液液中NaCl体积数 NaCl 体积 z ( uL) NaCl最终浓度(mM) 甲酰胺浓度％ 0 L 0 10 15 20 25 30 35 40 45 50 L L

9000 00 4600 3280 2250 1590 1120 800 560 400 280 200 460 328 225 159 112 80 . 56 40 28 . 20 900 0 J 表2 上 鼻 不同甲酰胺对应的洗涤液的配制

甲酰胺浓度 (%) IM Tris-HCl (mL) 20 35 40 55 8 8 8 8 0.4 0.4 0.4 0.4 10% SDS (mL) 0. 5M EDTA (mL) 4 4 4 4 5M NaCl溶液 (mL) 18 6.4 4.48 1.6 无菌水体积 (mL) 369.6 381.2 383. 12 386 9、A9,6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI) 常备：1 mg Hl-1 需要稀释为:1 Pg h

灭菌储存在-20°C (用铝箔覆盖管子)

DAPI可诱变致癌，所以在使用时要戴手套并且收集废液，包括早使用移液管时。

为了避免使用时对溶液造成污染，所有的溶液应取出置于50ml管中，够每天使用的量。

三、实验步骤:

1、玻片的预处理： (1)玻片预处理

1)玻片清洗：

载玻片与盖玻片用热肥皂水刷洗干浄，在实验室可用超声淸洗代替刷洗(4~5次每 次10 min),然

后用淸水浸泡过夜；

2)硅化处理：

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第二天换用1%的盐酸浸泡24小时,然后用蒸馅水淸洗干净后放入髙压灭菌锅火菌， 60°

C烘干。盖玻片用锡纸包好4° C保存备用。（盖玻片干净即可,不用处理）

（2）黏附剂涂片制备

载玻片放入APES与丙酮的1:50溶液（现配现用）中约lmin,取岀用高压灭菌处理 过的蒸餾水淸洗后于室温下干燥（也町放入烘箱里25° C烘「），然后置4°C保存备用 2、 荧光探针的选择和标记（见fish3、 样品的制备与固定

（1）

探针的选择表）

用已火菌的聚乙烯取样管取反应器内泥水混合液ImL,加适量火菌蒸馅水振荡混匀， 并用超声

波处理使细菌分散。取处理后的悬浊液约0.5ml进行后续处理。

（2） 将悬浊液混合均匀后，按1:1加入4%多聚甲醛，于4°C固定24小时， （3）

然后置于12000r/min离心5min去除固定剂,将固定样本加入lml 0. 01mol/L PBS 以lOOOOr/min的速度

离心漂洗两次，弃去上淸液。

（4） 采用PBS与乙醇的1:1溶液稀释泄容至lml于吃0°C保存备用

4、 样品的预处理

（1） 用微型振荡器将样品混合均匀，取10 口1样品在载玻片上涂抹20mmX20mm大小（不要 太大），37C的烘箱热固定2h,最高温度不超过60°C

（2） 风干后于50%、80%、95%的乙醇中各脱水3min,自然风干。

（脱水:准备三个瓷盘，然后将载玻片取出依次放入瓷盘中,用50%乙醇淹没裁玻片, 脱水3mim

取出放入第二、三个瓷盘,然后用80%乙欝脱水,96%乙醇脱水。脱水后的80%、 96僞乙醇回收。）

脱水后的玻片可以在室温下保存几个月，可在-209的条件下保存几个月

5、 原位杂交

探针浓度为50ng/ LX L,

在密闭的杂交盒内铺满吸水纸（经高压火菌烘干），用杂交液湿润，使杂交环境保持一 龙的湿度。用移液分别取24 UL的杂交液和1PL探针滴入带有样品的载玻片上（均匀覆 盖涂片而积），（加盖硅化盖玻片，不用）放入杂交盒内进行杂交反应。杂交温度与杂交时间 如下。

所有有关探出 t的操作在处理时都应避光处理！ 探针种类 EUB MIX AOB MIX NOB MIX GAO MIX HGC69a

PA0651 6、 杂交后洗涤

温度（’C） 46 46 46 46 46 46 时间（h） L 甲酰胺浓度％ 20 55 10 30 30 30 备注 同步染色法 重复染色法 重复染色法 同步染色法 同步染色法 同步染色法 □ 3 5 2.5 2.5 2.5 从恒温箱中取出玻片之前将盛有淸洗液的容器放入到48°C的水浴中预热20分钟。杂交 完成后取出玻片，立即放入到预热好的容器中。注意不能让玻片干燥，不然将很难洗去非特 异性结合的信号，增加背景染色。淸洗液的量应当淹没玻片，淸洗15〜20分钟后取出，用 淸水洗去剩余的淸洗液，然后室温下晾干。

7、 DAPI染色

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每个玻片用10 UL DAPI （用甲醇稀释至lUg/UL）滴加到载玻片样品上，在冰上染 色lOmin,用水冲洗多次，室温下自然晾干，镜检前加盖盖玻片。 8、荧光显微镜观察

经过以上处理的样品，用荧光显微镜进行观察。

探针

EUB338

目标菌群

Domain Bacteria

探针序列

GCTGCCTCCCGTAGGAGT

甲酰胺浓度

20% 55%

修饰

HEX HEX FITC

NS0190 Ammonia ^oxi di zing bacteria CGATCCCCTGCTTTTCTCC

NIT3

CCTGTGCTCCATGCTCCG

Ni trite^oxidizing bacteria

Competibacter Actinobacteria Accumulibacter Denitrifier

cNIT3 GAOQ9 HGC69a PA0651

b

CCTGTGCTCCAGGCTCCG TTCCCCGGATGTCAAGGC TATAGTTACCACCGCCGT CCCTCTGCCAAACTCCAG

CGGGAGGCAGCAGT

40% 35% 25% 35% 35%

Cy5™ FITC Cy3™ FAM

b

注：。探针浓度均为50ng/uL： cNIT3为菌探针门T3的竞争探针。

Abbreviation FITC （绿色） DAPI （蓝色） maximum absorption 492nm Maximum emission 528nm Filter set 10(Zeiss) 02 (Zeiss) 365 nm CY3 （橙色/红色） CY5 （红外线检测） 418 nm 570 nm 667 nm 5 nm 650 nm 15 (Zeiss) 26 (Zeiss) HEX

探针的选用

选用EUB MIX（EUB338. EUB338II、EUB338III）来检测活性污泥中的全部的细菌匚 选用PAOMIX来检测活性污泥中的聚磷菌， 选用AOB MIX NOBMIX来检测活性污泥中的硝化菌。 选用GAOMIX探针来检测活性污泥中的聚糖菌，

选用HGC69a探针来检测反硝化聚磷菌的优势菌种Actinobacteria,

用 PA0651 来检测优势菌种 Rhodocyclust 杂交后用 40 , 6-diamidino-2-pheindo 1 e dihydro-chloride （DAPI） （1:1,000 稀释）和 PHB 进行 复染样品。

试剂与材料：

NaHcPO, • 2HO Na：HP0i • 12HA NaCl：

多聚甲醛PFA；

150吕三羟基氨基甲烷（Tris）,浓HC1, NaOH； 十二烷基硫酸钠（SDS）；

乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：

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100% 甲酰胺：

DAPI；

载玻片，盖玻片•吸水纸.瓷盘（带盖）：

精心整理，希望对您有所帮助!