第３０卷第３期 ２０１１年５月 食品与生物技术学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ０ｌ０ｇｙ ＶｏＬ ３Ｏ ＮＯ．３ Ｍａｙ ２０１１ 文章编号：１６７３—１６８９（２０１１）０３—０３９４—０４ Ｌ一缬氨酸高产菌诱变育种的研究 ， 钱和。 （１．江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡２１４１２２；２．江南大学生物工程学院， 江苏无锡２１４１２２；３．江南大学食品学院，江苏无锡２１４１２２） 摘 要：以黄色短杆菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）Ｉ 一缬氨酸产生茵ＸＱ＿２为出发菌株，经硫酸二乙 酯（ＤＥＳ）和亚硝基胍（ＮＴＧ）逐级诱变处理，氨基酸结构类似物ａ一氨基丁酸（ａ—ＡＢ）、２一噻唑丙氨酸 （２－ＴＡ）和ａ一氨基一Ｇ一羟基戊酸（ＡＨＶ）定向筛选，获得一株Ｌ一缬氨酸高产茵ＸＱ一８（Ｌｅｕ （一ＡＢ ２一 ＴＡ ＡＨＶｈ）。在以１３５ ｇ／ｉ 葡萄糖为碳源和５０ ｇ／Ｌ硫酸铵为氮源的培养基中摇瓶发酵７２ ｈ，产 酸达６４￣６６ ｇ／Ｌ。 关键词：Ｌ一缬氨酸；诱变育种；黄色短杆菌 中图分类号：ＴＱ ９２２ 文献标识码：Ａ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｌ—－Ｖａｌｉｎｅ Ｈｙｐｅｒ。－Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｍｕｔａｎｔ ＺＨＡＮＧ Ｗｅｉ—ｇｕｏ ¨． ＱＩＡＮ Ｈｅ。 （１．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ；３．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｓｉｎｇ Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＸＱ一２（Ｌｅｕ （一ＡＢ ＡＨＶ ２一ＴＡ ）ａｓ ａ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ｆｏｒ ｓｔｅｐＷｉｓｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｄｉｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ（ＤＥＳ），Ｎ—ｍｅｔｈｙｌ—Ｎ 。ｎｉｔｒｏ—ｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ（ＮＴＧ） ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ａ Ｌ—ｖａｌｉｎｅ ｈｙｐｅｒ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ＸＱ一８（Ｌｅｕ （一ＡＢｈ ２一ＴＡｈ ＡＨＶ ）ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ， ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａ—ａｍｉｎｏ—ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ（ａ—ＡＢ），２－ｔｈｉａｚｏｌｅ—ＤＩ 一 ａｌａｎａｉｎｅ（２一ＴＡ）ａｎｄ ａ—ａｍｉｎｏ—Ｂ—ｈｙｄｒｏｘｙ－ｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ（ＡＨＶ）． Ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔ，ｈｉｇｈ Ｌ－ｖａｌｉｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（６４～６６ｇ／Ｌ）ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｓｈａｋｉｎｇ ａｔ ３ １±１℃ｆｏｒ ７２ｈ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １３５ｇ／Ｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ５０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｌ—ｖａｌｉｎｅ，ｂｒｅｅｄｉｎｇ，ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ Ｉ 一缬氨酸是人体８种必需氨基酸之一，同时又 是３种支链氨基酸之一，因其特殊的结构和功能在 人类生命代谢中占有特别重要的地位，可广泛应用 于食品和医药等方面，但由于其生产成本较高，价 格较贵，目前主要用于配制复合氨基酸制剂，特别 是应用于高支链氨基酸输液（如３Ｈ输液等）和口服 液（肝安干糖浆等）。最近，人们发现Ｌ一缬氨酸是合 成一种治疗高血压的特效药——缬沙坦的重要中 间体，其年消耗量猛增到数千吨。 目前，国际上生产Ｌ一缬氨酸均采用发酵法。日 收稿日期：２０１０—０５—２５ 基金项目：国家８６３计划项目（２００８ＡＡ０２Ｚ２１２）。 作者简介：（１９６３一），男，江苏张家港人，工学博士，教授，博士研究生导师，主要从事氨基酸生产菌选育 和发酵工艺控制研究。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｗｇ１６８＠１２６．ｃｏｒｎ 第３期 等：Ｌ一缬氨酸高产菌诱变育种的研究 ３９５ 本的松琦氏选育的厌气杆菌在１００ ｇ／Ｌ的葡萄糖培 养基中产酸达１５ ｇ／Ｌ＿】 ；Ｔｓｕｃｈｉｃｌａ等选育的乳糖 发酵短杆菌摇瓶产酸达３１ｇ／Ｌｌ２ ；日本协和公司的 Ｌ一缬氨酸产酸水平达４Ｏ～５０ ｇ／Ｌｌ＿３］。中国科学院 胍（ＮＴＧ）为瑞士Ｆｌｕｋａ公司产品；（一氨基丁酸（（一 ＡＢ）、ａ一氨基一口一羟基戊酸（ＡＨＶ）和２一噻唑丙氨酸 （２一ＴＡ）为美国Ｓｉｇｍａ公司产品。 １．４诱变方法 微生物研究所于１９７５年在国内首次报道了Ｌ一缬氨 酸产生菌北京棒杆菌突变株ＡＳ１．５８６的选育，产酸 为２６ ｇ／ＬＥ 。“七五”期间中国科学院微生物研究 所进行了第二代缬氨酸高产菌的选育，摇瓶产酸提 常规化学诱变法［１ 。 １．５氨基酸结构类似物抗性株检出方法 将氨基酸结构类似物按一定浓度混合于基础 培养基中，制成平板后，涂布上述经诱变处理过的 高到３０ｇ／Ｌ［５］。选育的黄色短杆菌ＸＱ一２摇 瓶产酸达４２￣４５ｇ／Ｌ＿６］；浦军平等选育Ｌ一缬氨酸产 生菌种摇瓶产酸达４５ｇ／Ｌ＿７］。等选育的黄色 短杆菌ＸＱ一６摇瓶产酸达５８～６２ｇ／Ｌ ］。赵丽丽等 选育的缬氨酸高产菌ＴＶ２５６４，５ Ｌ罐补料分批发酵， 产酸达５Ｏ ｇ／ 。徐庆阳等选育的Ｌ＿缬氨酸高产 菌，１０ Ｌ发酵罐补料分批发酵７２ ｈ，产酸可达５３．４ ｇ／ ］。本试验对以前选育的Ｌ＿缬氨酸产生菌ＸＱ－６ 定向育种，产酸进一步提高，摇瓶产酸６４￣６６ ｇ／Ｌ，５０ Ｌ发酵罐补料分批发酵６８ ｈ产酸高达６８．７ Ｌ。 １材料与方法 １．１ 菌种 出发菌株为Ｌ．缬氨酸产生菌ＸＱ一２（Ｌｅｕ （一ＡＢｒ ＡＨＶ ２一ＴＡ ）。 １．２培养基 １．２．１ 完全培养基（ｇ／Ｌ） 葡萄糖５、牛肉膏１Ｏ、 蛋白胨１０、ＮａＣ１ ５、琼脂条２５。 １．２．２基础培养基（ｇ／Ｌ） 葡萄糖２０、（ＮＨ ） ＳＯ４ １．５、ＫＨ２ ＰＯ４ １、Ｋ２ ＨＰＯ４ ３、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２ Ｏ ０．５、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２ Ｏ ０．０１、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２ Ｏ ０．０１、 ＶＨ ３０ ｐｔｇ／Ｌ、ＶＢ１・ＨＣ１ １００／ｚｇ／Ｌ、尿素１．５、琼脂 粉２０。 １．２．３ 种子培养基（ｇ／Ｌ） 葡萄糖２５、 （ＮＨ４）２ＳＯ４ ５、ＫＨｚ ＰＯ １、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２ Ｏ ０．５、玉 米浆３５￣４０、尿素２．５、ＣａＣＯ３１０。 １．２．４ 发酵培养基（ｇ／Ｌ） 葡萄糖１２０～１５０、 （ＮＨ ）２ ＳＯ４ ３５～５０、ＫＨｚ ＰＯ １、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２ Ｏ ０．５、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２ Ｏ ０．０１、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２ Ｏ ０．０１、 ＶＨ ２５～１００ ｇ／Ｌ、ＶＢ ・ＨＣ１ ５０￣ｔｇ／Ｌ、玉米浆５～ １０、ＣａＣＯ３ ４０。 完全、基础和种子培养基均以２０ ｇ／ｄＬ ＮａＯＨ 调ｐＨ至７．５～７．６，０．１ ＭＰａ压力下灭菌２０ ｒａｉｎ。 发酵培养基以２０ ｇ／ｄＬ ＮａＯＨ调ｐＨ值为７．５～ ７．６，０．０７ ＭＰａ压力下灭菌８ ｒａｉｎ。 １．３主要试剂 硫酸二乙酯（ＤＥＳ）为上海试剂厂产品；亚硝基 菌体，置３０℃恒温箱中培养３～５ ｄ后长出的大菌 落，即是氨基酸结构类似物抗性变异株。 １．６分析方法 １．６．１ ｐＨ值测定用酸度计测定法。 １．６．２ 菌体生长 吸取样品菌液０．２ ｍＬ加到５ ｍＬ浓度为０．２５ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣ１溶液中，摇匀后测定 Ａ 值。 １．６．３ 葡萄糖 采用ＳＢＡ一４多功能谷氨酸一葡萄 糖分析仪测定。 １．６．４ Ｌ一缬氨酸 纸上层析法、比色定量法ＥｌＺ３和 氨基酸分析仪测定。 ２结果与讨论 ２．１ Ｌ－缬氨酸高产菌ＸＱ－６的选育谱系 ２．１．１ ａ—ＡＢｈ变异株的获得 从ＸＱ一２出发，经 ＤＥＳ诱变，高浓度ａ—ＡＢ平板筛选，获得ａ－ＡＢｈ变异 株２１５株，经摇瓶筛选获得一株Ｌ一缬氨酸高产菌 Ｖ５—１２８，产酸质量浓度为４５￣４７ｇ／Ｌ。 ２．１．２ ２－ＴＡ 变异株的获得 在获得Ｖ５－１２８的 基础上，经ＮＴＧ诱变，高浓度２一ＴＡ平板筛选，获 得２一ＴＡ 变异株１６３株，其中有几株Ｌ一缬氨酸积累 有不同程度的增加，代表性株Ｖ６－５６的产酸达５５～ ５６ ｇ／Ｌ。 ２．１．３ ＡＨＶｈ变异株的获得 继续由ＮＴＧ诱变， 高浓度ＡＨＶ平板筛选，获得ＡＨＶｈ变异株９８株， 其中有几株Ｌ＿缬氨酸积累有不同程度的增加，代表 性株Ｖ７—８７的产酸达６０￣６２ ｇ／Ｌ，经单菌落分离发 酵条件优化，产酸稳定在６４￣６６ ｇ／Ｌ。 ２．１．４ Ｌ一缬氨酸高产菌ＸＱ一８的选育谱系 从选 育的Ｌ＿缬氨酸产生ＸＱ－２出发，经ＤＥＳ和ＮＴＧ诱 变处理，Ｌ一缬氨酸结构类似物定向选育，得到Ｌ一缬 氨酸高产菌ＸＱ一８，具体选育谱系见图１。 ２．２ Ｌ一缬氨酸高产菌ｘＱ８发酵条件的研究 ２．２．１ 各种营养物质对产酸的影响 考察了生物 素对ＸＱ－８菌株Ｌ一缬氨酸发酵的影响。结果表明， 生物素为ＸＱ一８菌株生长和产酸的唯一必需因子， 缺之，菌体不能生长和产酸（见图２）。当生物素添 ３９６ 食品 与 生 物技术 学报 第３０卷 菌株 质 ／Ｌ） 黄色短杆菌ｘＱ．２（Ｌｅｕ ｄ—ＡＢ ＡＨＶ＇－２ＴＡ ）４０～４２ 上。Ｅｓ Ｖ５．１２８（Ｌｅｕ ＡＨＶｒ２．ＴＡ Ⅱ．ＡＢｈ￣）４５￣４７ ＴＧ Ｖ６．５６（Ｌｅｕ ＡＨＶ Ⅱ．ＡＢｈｒ＿ＴＡ ５５￣５６ Ｖ７．８７（Ｌｅｕ’ａ． Ｂ ２．ＴＡ ＡＨＶ 、ＪｒＮＴＧ ６０￣６２ Ｉ单菌落分离及工艺改良 ＸＱ．８（Ｌｅｕ ｄ．ＡＢ ２．ＴＡ ＡＨＶ￣） ６４～６６ 上标ｌ一渗漏型；ｒ一抗性ｈｒ－－￣抗 图１ Ｌ－缬氨酸高产菌ｘＱ－８的选育谱系 Ｆｉｇ．１ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｃｈａｒｔ ｏｆ ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ Ｌ－ ｖａｌｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｘＱ－ｏ８ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ卜ｌｅａｋｙ ｍｕ— ｔａｎｔ ｒ＿ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｈｒ－ｈｉｇｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ 加质量浓度为４０～５０／．ｔｇ／Ｌ时，可获得较高的Ｌ一缬 氨酸积累。由于只添加纯生物素时前期菌体生长 较慢，故进行添加生物素同时添加少量玉米浆发酵 试验，结果表明，当添加４０～５０ ｔ￣ｇ／Ｌ生物素和０。５ ｇ／ｄＩ 玉米浆时，Ｌ一缬氨酸积累最高，达６４～６６ ｇ／Ｌ （见图３）。 ７ ６ ｓ 咖ｌ ４ 聪２ １ 生物素质量浓度／（ｕ ｇ／Ｌ） 图２ 生物素对Ｌ一缬氨酸发酵的影响 Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｂｉｏｔｉｎ ｏｎ Ｌ ｖａｌｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ 生物素质量浓度／（１Ｉ ｇ／Ｌ） 图３添ＪＪ０￣．米浆时生物素对Ｌ．缬氨酸发酵的影响 Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ ａｎｄ ｂｉｏ— ｔｉｎ ｏｎ Ｌ—ｖａｌｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｔ ｏｎｅ ｔｉｍｅ 添加支链氨基酸（Ｌ一亮氨酸和Ｌ一异亮氨酸），当 浓度较低（≤２ ｇ／Ｌ）时，对Ｌ一缬氨酸发酵的影响不 大（如图４所示）；只有当支链氨基酸的浓度较高 （≥６ ｇ／Ｌ）时，则影响较大（如图５所示）。 蛏 嘲 锚 腻 爨 Ｏ ２ ４ ６ ８ ｌＯ Ｌ一异亮氨酸质量浓度／（ｇ／Ｌ） 图４ Ｌ一亮氨酸对Ｌ一缬氨酸发酵的影响 Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｌ－ｌｅｕｃｉｎｅ ｏｎ Ｌ－ｖａｌｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ８０ 越 ６０ 蠖 皿唧 ４０ 峰 腻 ２０ Ｏ ０ ２ ４ ６ ８ ｌＯ Ｌ－异亮氨酸质量浓度／（ｇ／Ｌ） 图５ Ｌ－异亮氨酸对Ｌ一缬氨酸发酵的影响 Ｆｉｇ．５ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｌ‘ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ ｏｎ Ｌ－ｖａｌｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２．２．２ ＸＱ一８菌株Ｌ一缬氨酸最佳发酵条件 应用 正交试验法综合考察了培养基成分、种龄、接种量 等多种因素对菌株产酸的影响，得到的最佳发酵条 件列于表１。 表１ Ｌ－缬氨酸摇瓶发酵的最佳条件 Ｔａｂ．１ Ｏｐｔｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｌ－ｖａｌｉｎｅ ｐｒｏｄｕｅ－ ｔｉｏｎ ２．２．３ ｘＱ－８菌株Ｌ一缬氨酸发酵进程曲线 图６ 为一缬氨酸高产菌ＸＱ８的典型发酵过程曲线。图６ 中，Ｏ～１２ ｈ为菌体生长延滞期，此时菌体耗糖速率 较慢，主要用于长菌，基本不产酸；１３～３６ ｈ为菌体 生长对数期，此时生长速率达到并保持最大，耗糖 第３期 １ 等：Ｌ一缬氨酸高产菌诱变育种的研究 ３９７ 着共同的酶，因此代谢调节机制较为复杂。在合成 途径中存在：（１）缬氨酸对ａ一乙酰羟基酸合成酶 （ＡＳ）有抑制作用；（２）缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸对 ＼ ｂｏ ０ 蚤 ０蟮 姆 婶 ｛霹 矮 咖１ 喀 ａ一乙酰羟基酸合成酶（ＡＳ）有多价阻遏作用。 Ｌ一缬氨酸生物合成的限速酶为ａ一乙酰羟基酸 合成酶（ＡＳ）。因此，如果要在培养基中积累大量 Ｌ一缬氨酸，就必须解除正常的反馈调节，即解除Ｌ一 缬氨酸对ａ一乙酰羟基酸合成酶（ＡＳ）的反馈抑制及 Ｌ一异亮氨酸、Ｌ一缬氨酸和Ｌ一亮氨酸对ａ一乙酰羟基酸 键 蜮 时间／ｈ 合成酶（ＡＳ）的多价阻遏。ａ—ＡＢ为Ｌ＿缬氨酸的结 构类似物，其高浓度抗性突变株可解除了Ｌ＿缬氨酸 对ａ一乙酰羟基酸合成酶（ＡＳ）的反馈抑制；２一ＴＡ为 图６ Ｌ－缬氨酸发酵过程曲线 Ｆｉｇ．６ Ｔｉｍｅ－ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ Ｌ。ｖａｌｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｌ＿缬氨酸和Ｌ一亮氨酸的结构类似物，其高浓度抗性 速率明显加快，并开始产酸；３７～６４ ｈ进入菌体稳态 生长期，此间耗糖速率较快，Ｌ厂缬氨酸大量合成；６５～ 突变株也同样可解除了Ｌ一缬氨酸和Ｌ一亮氨酸对ａ一 乙酰羟基酸合成酶（ＡＳ）的多价阻遏，使得Ａｓ的酶 活极大幅度地提高，其结果在培养基中积累大量Ｌ一 缬氨酸；ＡＨＶ为苏氨酸的结构类似物，其抗性突变 株为何能提高Ｌ一缬氨酸的积累？其机制尚没有解 Ｌ一缬氨酸与Ｌ一亮氨酸和Ｌ一异亮氨酸的生物合 成途径是相关的，这３种氨基酸的生物合成，存在 明，是否存在ＡＨＶ抗性可解除异亮氨酸对ＡＳ的 多价反馈调节，这一点值得进一步探讨。 ７２ ｈ为衰亡期，此间耗糖速率减慢，直到发酵结束。 ３ 结 语 参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）： ［Ｉ］木下祝郎．Ｌ一缬氨酸菌种的选育ＥＭ］．新版发酵工业，１９７４，（１）：５． ［２］张克旭．氨基酸发酵工艺学［Ｍ］．北京：中国轻工业出版社，１９９２，６７８． ［３］冯容保．氨基酸的工业生产［Ｊ］．发酵科技通讯，２０００，２９：１． ＦＥＮＧ Ｒｏｎｇ—ｂａｏ．Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ［Ｊ］．Ｆａ Ｊｉａｏ Ｋｅｊｉ Ｔｏｎｇｘｕｎ，２０００，２９：１．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［４］中国科学院微生物研究所氨基酸组．Ｌ一缬氨酸产生菌ＡＳ１．５８６的选育．微生物学报，１９７５，１５（４）：３２５ ３３０． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＣＡＳ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｌ－ｖａｌｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｅｒ ＡＳ１．５８６［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｉｎ．１９７５，１５（４）：３２５～ ３３０．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［５］王秀岭，屈明波，黄和容．多重抗性突变株Ｌ一缬氨酸发酵口］．微生物学通报，１９９０，１７（５）：２７６￣２７９． ＷＡＮＧ Ｘｉｕ—ｌｉｎｇ，ＱＵ Ｍｉｎｇ—ｂｏ，ＨＵＡＮＧ Ｈｅ—ｒｏｎｇ．Ａ ｍｕｌｔｉ—ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｓ ｍｕｔａｎｔ ｆｏｒ Ｌ－ｖａｌｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｅｒ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． １９９Ｏ，１７（５）：２７６～２７９．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［６］，钱和．Ｌ一缬氨酸菌种的选育［Ｊ］．元锡轻工业大学学报，１９９５，（３）：２２１—２２４． ＺＨＡＮＧ Ｗｅｉ—ｇｕｏ，ＱＩＡＮ Ｈｅ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｌ－ｖａｌｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｅｒ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｗｕｘｉ Ｕｎｉｖｅｓｉｒｔｙ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，１９９５，（３）： ２２１—２２４．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［７］浦军平，肖泉，林学军．一次性高搪发酵Ｌ．缬氨酸菌种选育及发酵条件ＥＪ］．大连轻工业学院学报，２００１，２０（４）：２６４－－２６７． ＰＵ Ｊｕｎ－ｐｉｎｇ，ＸＩＡＯ Ｑｕａｎ，ＬＩＮ Ｘｕｅ－ｊａｎ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ－ｖａｌｉｎｅ ｉｎ ｈｉｇｈｇｌｕｅｏｓｉｄｅ ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｌｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，２００１，２０（４）：２６４—２６７．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［８］，钱和． 缬氨酸高产菌选育及营养需求研究［Ｊ］．沈阳药科大学学报，２００１，１８（６）：４４３—４４６． ＺＨＡＮＧ Ｗｅｉ—ｇｕｏ，ＱＩＡＮ Ｈｅ．Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｌ－ｖａｌｉｎｅ ｈｙｐｅｒ—ｐｒｏｄｕｃｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．２００１，１８（６）：４４３—４４６．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［９］赵丽丽，张蓓，陈宁等．Ｌ广缬氨酸补料分批发酵的研究［Ｊ］．南开大学学报：自然科学，２００２，３５（４）：１０６—１１０． ＺＨＡ０ Ｌｉ—Ｉｉ，ＺＨＡＮＧ Ｐｅｉ，ＣＨＥＮ Ｎｉｎｇ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｅｅｄ ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ—ｖａｌｉｎｅｆ Ｊ】．Ａｃｔａ Ｓｃｉｅｎｔｉａｒｕｍ Ｎａｔｕｒａｌ－ ｉｕｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｎａｎｋａｉｅｎｓｉｓ．２００２，３５（４）：１０６—１１０．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） Ｅｌ０］徐庆阳，刘树海，陈宁．Ｌ一缬氨酸的发酵工艺研究［Ｊ］．生物技术通讯，２００６，１７（３）：３８１—３８６． ＸＵ Ｑｉｎｇ－ｙａｎｇ，ＬＩＵ Ｓｈｕ—ｌｉ，ＣＨＥＮ Ｎｉｎｇ．Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ Ｌ—ｖａｌｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａ— ｖｕｍ［Ｊ］．Ｌｅｔｔｅｓ ｒｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｉｏｇｙ．２００６，１７（３）：３８１—３８６．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［１１３章名春．工业微生物诱变育种Ｉ－Ｍ］，北京：科学出版社，１９８４ －１１２］潘家秀．蛋白质化学研究技术［Ｍ］，北京：科学出版社，１９６２
