雄性sd大鼠视网膜发育转录组分析

武汉轻工大学学Journal of Wuhan Polytechnic 报 University

Vol. 38 No. 6

Dec. 2019

文章编号:2095-7386(2019)06-0020-07

DOI；10. 3969/j. issn. 2095-7386. 2019.06.005

雄性SD大鼠视网膜发育转录组分析

李云，吕家红，陈淑芬，董鑫洁，赵秀举

(武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023)

摘要：研究SD大鼠视网膜发育中的基因表达谱变化。对微阵列技术检测出的基因表达量

进行T检验和SAM (Significance Analysis of Microarrays)，计算

值和变化倍数，筛选符合条件

的基因（P <0.05和变化倍数大于1.05或小于0.95作为差异表达基因的筛选标准），得到通 路和网络变化图。结果显示：SD大鼠一个月和三个月的发育过程中筛选出51个可能与视网 膜发育有关的候选基因，其中有Krt8、Lox、Cryga、Dusp6、CrygX等42个基因的表达量呈现下调 趋势，O[n4! LamC2!Etv4等9个基因表达呈上调趋势，这些差异基因主要参与运输、转录调节、眼睛发育、细胞黏附和蛋白质水解等通路。研究有助于深入理解视网膜发育的分子机理。

关键词！视网膜发育；网络图；转录组中图分类号! Q 522

文献标识码:A

Transcriptomeanalysis of retinal development in male SDrats

LI Yun，LV Jia-hong，CHEN Shu-fen，D0NG Xin-Jie，ZHA0 Xin-Jn

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China) Abstract;Objective:To study the expression and pathway of genes in the development of retina in SD rats. Meth­ods ；T - test and SAM ( microarray significance analysis) were performed on microarray data of gene expression.The P value and the change fold were used to screen the genes that met the criteria to obtain the pathway and a net­work change map. Results ；P < 0. 05 and Fold Change > 1.05 or <0. 95 as screening criteria for diferentially ex­pressed genes，51 candidate genes related to retinal development during the development of SD rats from one month and three months were

screened，including

Krt^8，Lox，Cryga，Dusp6，Crygb

and

otlier

42

genes

were

ted ，Opn4，Lamc2，Etvz4and otlier 9 genes were up - regulation. These diferential genes are mainly involved in trans­port ， transcrij^tional regulation，eye development，cell adhesion，and proteolysis patliways. It provides a new point for further understanding of the molecular mechanism of retinal development.Key words ; retinal development % network map % transcriptome

1引言

头足纲动物眼球内部后面的一层很薄大概十层的细 胞层，它的功能就是通过眼睛来接收外界的光信号，

视网膜，又名外周脑，是存在于脊椎动物和部分然后在其表面上转化成神经信号传递给大脑。

收稿日期:2019-09-21.

作者简介:李云（1995-)，男，硕士研究生，E-mail: 12467474@qq.cm. 通信作者:赵秀举（1980-)，男，畐!)教授，E-mail:dzrdez@ 163. com.基金项目：湖北省教育厅科技计划重点项目（D20191603).

#期

李云，吕家红，陈淑芬，等:雄性SD大鼠视网膜发育转录组分析

21

以往视网膜发育的相关基因表达的研究主要集 中在外因诱导后大鼠视网膜基因表达差异和一个或 者一类基因的表达以及某个通路在视网膜发育中的 作用。例如等人研究出了钙调蛋白基因在 成年大鼠神经视网膜中的表达[1]。Li等人报道了

Nuirl在大鼠视网膜发育中的表达模式[2]和Shi等

人发现了 Notch信号通路在视网膜发育和血管生成 中的作用[3]。这些研究主要侧重外因诱导或者缺 乏整体性，笔者基于正常雄性SD(SPrague-Daw-

ley)大鼠为模型，基于转录组学的技术[47]研究大鼠

视网膜发育相关基因的表达具有整体性的优势， 因此，有必要整体深入研究一下个体视网膜发育， 从而为下一步深入理解视网膜发育的分子机理提 供新的切入点。

在本文中，笔者以SD大鼠视网膜为模型，比较 了一月龄和三月龄的基因表达谱，并进行了微阵列 显著性分析[81°]和差异表达基因所参与通路分析， 揭示视网膜发育过程的转录模式。

#材料与方法

2.1实验

本研究中的所有实验均根据人11<0(\\16人33〇-

ciation for Research in Vision Ophthalmology)关于使

用动物眼科和视力以及区域动物伦理委员会的声 明，该研究得到了伦理委员会Regierungsprasidium

Karlsruhe 的批准，批准 ID:35 -9185. 81/G -93/05o

动物来自于德国曼海姆大学医学院医学研究中心。 将6只雄性SD大鼠分成2组（8 = 3 )，单笼饲养，环 境湿度65 ± 15T，室温23 ± 2 f，保持12 h光照和

12 h黑暗循环，自由获取食物和饮用水。在1个月

和3个月龄时，将SD大鼠麻醉，摘取眼球，并且在 脱颈椎处死后立即冷冻眼球以便随后制备总RNA 勻浆。

2.2 RNA分离

根据制造商的方案，使用Trizol试剂（Invitrogen，

Germany)单独提取视网膜总RNA。（ 1 )将组织在液

氮中磨碎，每50—100 mg组织加入1 mL TRIzl，用勻 浆仪进行勻浆处理。（2)将勻浆样品在室温（15—

30 f )放置5 min，然后加入0. 2倍体积氯仿，剧烈振

荡 15 s，室温放置3 min。4 f 10 000 Xg 离心 15 min。 样品分为三层:底层为黄色有机相，上层为无色水相 和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为 所用TRIzl试剂的60T。（3)把水相转移到新管 中，用异丙醇沉淀水相中的RNA。加入0. 8倍体积

异丙醇，室温放置10 min。4 f 10 000 X g离心

10 min，离心后移去上清。（4)用75%乙醇洗涤 RNA沉淀。使用1倍体积75%乙醇。4 f 7 000 Xg离心5 min，弃上清。（5)重复步骤（4) 一

次。（6)室温放置干燥RNA沉淀，晾5 min。加入

100 #L无RNase的水溶解，用头吸打几次，55 f

放置10 min使RNA溶解。通过分光光度法控制

RNA的质量和纯度，并通过在1 %琼脂糖凝胶上电

泳评估。

2$基因差异分析

根据制造商的建议进行cDNA和CRNA合成。

cDNA的合成，一步合成法合成CDNA的第一链和

第二链：（1)取2 #gRNA于1.5 mL离心管中，如 下配置反应溶液：总RNA2 #g，6. 5 #L T7 Promo­

tor primer，5 #LRnase - free Water Xul，反应溶液总

体积 11.5 #L。（2)65 f 保温 10 min，冰浴 5 min， 提前把5 X First Strand Buffet•在金属浴的80 f预 热5 min。（ 3 ) cDNA 合成体系：5 xFirst Strand

Buffer 4 #L，0. 1 MDTT 2 #L，10 mM dNTP mix 1 #l，MMLV RT1 #l，RNase OUT0. 5 #L，总体积 8.5 #L。（4)将上述8.5 #L mix加入变性后冰浴

的RNA中。（5 )用头混勻后进行离心。

(6)PCR:热盖 65 f&40 f 2 h&65 f 15 min、4 f 5 min。（7)cDNA电泳检测，取约5 #L反应产物，

在1 %琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，紫外灯下检测， 呈现出大小在200 — 10 kb的拖带，其中重心区域 小1 一 4 kb之间，这说明反转录完全，得到了高质 量的cDNA。cRNA的体外转录合成：（1)如下配置

IVT 混合液：IVT Biotin Label 4 #L，IVT Labeling Buffer 20 #L，IVT Enzyme Mix 6 #L，Total volum30 #L，然后轻轻振荡混勻，低速离心收集反应液到

管底。再转移30 #LIVT混合液至（30 #L)双链

cDNA样品管中，混勻，低速离心收集反应液到管

底0 (2)CR:热盖 60 f、40 f 2 h、4 f pause。然 后立即进行纯化，通过分光光度法控制RNA的质量 和纯度。片断化cRNA后与来自Affymetrix\" Santa

Clara，CA，USA)的Rae230_2型阵列的杂交，它包含31 099个单链核苷酸（25聚体）构成的基因探针。

大鼠视网膜样品总RNA与该表达谱芯片杂交，用于 检测其基因表达变化，每个样品使用一个芯片。芯 片杂交实验过程如下：（1)根据手册指导在新的1.5

mL RNase - free离心管中加入样品配制杂交液，20 X Eukaryotic Hybridization Controls 冻存，使用前 65 f，5 min。（2)使用前室温平衡探针。（3)99 f，5

22

武汉轻工大学学报2019 年

min。（4)通过加样孔加入适量体积1 X Hybridiza­tion Buffet•湿润芯片。 （5)45 f ,60 r/min 预杂交芯

表达

2.5通路分析

变 基 。

片10 min。（6)步骤（3)处理过的样品45 °C,5 min。

(7)最大速离心5 min。\"\"）从芯片中取出Buffer,加

在基因分析基础上使用分子注释系统（Capital-

Bio Molecule Annotation System\" MAS) version 4.0) 进

等体积处理好的杂交液。（9)45 C$60 r/min杂交 芯片16 h。每种组合应用三个阵列，共有6个阵列 杂交。杂交结束后，洗脱、染色、扫描芯片，使用Agi­

lent 扫描仪得到图像 ，将图像导入图像分析软件 Im- agene，提取得到基因表达的荧光信号强度值，最后

行通路分析（http://Xioinfo. capitalXio. com/mas) '11(。 通路分析基于REGG和GenMAPP数据库。2.6构建网络变化图

利用cytoscape3. 3.0软件建立了“基因一通路” 网络模式，绘制差异表达基因所参与的的通路网络 图，以基因和其所参与的通路为节点，建立相互关 系，导入 cytoscape3. 3. 0 软件，运用 network analyzer 软件分析SD大鼠视网膜转录组数据的“基因一通 路”网络图。在网络中，以节点（node)表示差异表 达基因和通路，以边（edge)相连接表示某一个差异 表达基

与 一个通

。

以列表形式给出，每个探针信号对数转换后，使用

Affymet/x Dchip 2006以芯片总信号为基准进行归

一化，预处理的数据先使用Cluster 3. 0 ( Standford

Uni:/ity)进行无监督聚类分析，然后使用T检验

和微阵列显著性分析。将符合MIAME ( Minimum

information about a microarray expe/ment)的微阵列

数据提交给 GEO (Gene Expression Omnibus)，样品 编号 GSE20967。2.4表达显著变化基因

基于方差齐性的前提下进行T检验，否则就进 行非参数检验（SPSS 22. 0)。本研究使SAM for Ex­

cel version 3. 0 进行两组非成对变量比较，按照假发

3结果

SD大鼠视网膜发育从一月龄到三月龄具有差

3.1差异基因分析

异表达的基因有51个，其中下调基因总共有42个， 如表1所示，上调基因总共有9个，如表2所示。

现率小于5%和变化倍数大于1.05或者小于0. 95

表1 表:

Public ID

1367553_x_at1367608_at1367703_at1367939_at1367990_at1368171_at1368321_at1369953_a_a1369985_a1370239_at1370292_a_at1370410_at1371102_x_at1371408_a1371413_x_a1371530_at1373740_a1374384_a1374496 at

HbbCryba4CrygdRbp1Crybb3LoxEgr1Cd24Crybb1

Hba-a2 /// LOC360504Crygc

Igsf1

LOC100134871 MGC72973Cryba1CrygbKrt8---------#CrygaRGD1310827

/// LOC60

///

Gene Symbol

PFOLD0.83790.78570.66190.920.75720.940.85060.88190.77910.85130.70850.94490.84490.78800.71150.92180.94810.75330.9456

3.9E-040.03390.00180.04370.01610.00110.01710.01060.02016.8E-040.00860.02550.00010.03040.01180.03980.03630.02050.0161

#期李云，吕家红，陈淑芬，等:雄性SD大鼠视网膜发育转录组分析

23

续表

Public ID

1375519_at1379038_at

LOC287167---------#Dusp6

1379281 _at138009Q_a_a13810Q2_at138Q2Q1_at1385071_a1387221_at138785Q_a1387931_at1388385_a1388Q35_a13887Q6_at13170_at13918_a1390636_at1392382_a1392716_at139Q077_at1395075_a1398270_a13983Q8_a—

#!未注释的基因。

SostddZfp212Anapc10CrygnRGD1563955Gch1Col1a2CrygeCryba2CrygsSerpine3Casp7LOC29070Q---------#Tgfb2---------#Rnd3---------#Bmp2---------#

Gene Symbol

PFOLD0.91870.94920.88060.92620.86750.94420.84470.92280.94850.930.760.79660.79600.430.93450.94810.93260.93680.92160.94670.94950.930.9207

8.QE-050.00580.02750.0Q3Q0.03650.022Q0.02200.025Q0.022Q0.02010.02140.03990.04450.04780.00560.04740.00200.00970.03030.01470.020.04230.0452

表

Public ID

137Q302_a137Q311_at1378Q08_a13793Q0_a1380168_a1383058_at139066Q_at1391391_at1392652_at—

#:未注释的基因。

OpnQRnf207RGD1563351Lamc2Etv4---------#

2

表达下调的基因

P0.02140.00610.01210.00802.0E-0Q0.00320.00420.03250.0086

FOLD1.05801.06301.06601.05631.05241.06941.08301.07731.01

Gene Symbol

LOC687361 /// Tmem116---------#---------#

3.2通路分析

大鼠视网膜发育差异基因通过MAS注释对基 因进行通路分析，得到与发生显著变化基因有关的

通路，然后从中选出与视网膜发育相关的通路，如表

3所示。

24

武汉轻工大学学报2019 年

表

Pathway

transporteye development

blood vessel developmentcell adhesionsignal transductionapoptosis

regulation of transcription，DNA - dependentproteolysis

induction of apoptosis

lens development in camera - type eyenegative regulation of cell proliferationprotein heterooligomerizationpositive regulation of transcription

positive regulation of cell adhesion mediated by integrincell differentiation

dopamine biosynthetic process

$ : up - regulated % #: d〇Fn - regulated。

3

相关信号通路

Genes

Hbb # hba - a2///LOC360504 # LOC287167 #LOC100134871 /// LOC60 /// MGC72973 #Crygd # Crygc # Crygb # Cryge # -Lox # Colla2 # Tgfb2 #Cd24 # Lamc2 $Igsf1 # Opn4 $Krt8 # Cap7 #

Egr1 # Zfp212 # Et4 $RGD1563955 # Casp7 #Gch1 # Casp7 # Tgfb2 #Cryge # Crygs #!T£b2 # Bmp2 #

Hbb # hba - a2///LOC360504 # Gch1 #Egr1 # Etv4 $ Bmp2 #Cd24 # Tgfb2 #

Cd24 # Dusp6 # Bmp2 #Gch1 # Tgfb2 #

P2. 2E -040.00790.00590.00920.02330.01490.0050.01190.01070.03080.02020.00180.00530.01010.02310.0147

3.3构建网络变化图

结果如图1所示。图1直 异表达基因与1#条作用通 网

节点

前（作

通

现了 25个差

。分析

基 4)，为网 “ 一*对多，多

纽节点，提示他们有可径；基与通路之间一

，体现视网S吴发育

对

是视网膜发育核心作 是基

结果表明，transport和eye development二条通路在

异表达

positive

通路共同作用机制。

positive

cell

内圈代表基因，外圈代表通路 图1

基因一通路网络图

#期

李云，吕家红，陈淑芬，等:雄性SD大鼠视网膜发育转录组分析

25

4讨论

从整个网络图我们不难发现，大多数基因都是

多功能基因，它的功能不仅仅是在某一通路中起到 某一方面的作用，而是通常在不同的通路中发挥着 不一样的作用，从而构成整个复杂通路网络，使每个 通路既相互又相互关联。

本数据分析旨在从SD大鼠一月龄到三月龄视 网膜发育差异来探讨对视网膜发育的影响，筛选出 了 51个与视网膜发育相关的差异表达基因，其中

42个基因发生了下调，'个基因发生了上调。通过

相关文献查阅后发现CrygZ、CrygX、Crygc、Cryge和

CrygS参与眼睛及其晶状体的发育，基因的表达量可

能与视网膜变性的严重程度，类型和发作有 关[1244]。HXX&G71 和 HXa - a2///LOC360504 参与 运输和蛋白质异源寡聚化过程，Egr1、ZfP212和Etv4 参与转录的调节过程，L*和C*a2参与血管生成，

N;1和〇P-4参与信号转导过程[15]，Cd24、Tgfb2、 Casp7和Bmp2(作用于途径差异表达基因数兰3)

是多功能基因，把11条核心作用途径联系起来。

转录组分析说明SD大鼠一月到三月视网膜发 育中以下过程产生了全面的影响:运输，眼睛发育， 血管发育，细胞黏附，信号转导，细胞凋亡，转录调节

与DNA依赖性，蛋白水解，诱导细胞凋亡，相机型眼 晶状体的发育，细胞増殖的负调节，蛋白质异源寡聚 化，转录的正调节，整合素介导的细胞黏附的正调 节，细胞分化，多巴胺生物合成过程。

通过对视网膜发育过程中差异表达基因的筛 选，为下一步深入理解视网膜发育的分子机理提供 新的切入点。参考文献：

[1]

Kovacs B,Gulya K. Calmodulin gene expression in the neural retina of the adult rat [ J ]. Life Sciences,2003,73(25% ：3213-3224.

[2]

Li Y，Qi Q，Cong B，et al. Expression patterns of Nurr1 in rat retina development [ J ]. Journal of Molecular Histology，2012，43(6% ：633-639.[3]

Shi S Y，Pei C W，Chen X L. Role of Notch sig­naling patliway in retina development and angio­genesis ][J ]. Zhonghua Yan Ke Za Zhi，2011， 47(12% ：1147-1150.[4]

Storck T，von Brevem M C，Behrens C K，et al. Transcriptomics in predictive toxicology [ J ]. Current Opinion in Drug Discovery & Develop­

ment ，2002 ，5 (1% ：90-97.

[5] HeijneWH，KienhuisAS，OmmenBV，etal.

Systems toxicology ： applications of toxicogenom- is，transcriptomics，proteomics and metabolo- mics in toxicology [ J ]. Expert Review ofPro- teomics，2005,2(5 % ：767-780.[6]

BarveRA，MinnerlyJC，WeissDJ，etal. Transcriptional profiling and pathway analysis of monosodium iodoacetate - induced experimental osteoarthritis in rats：relevance to human disease [J ]. Osteoarthritis Cartilage，2007，15 ( 10 %： 1190-1198.

[7]

Xiao B，Li L，Xu C，et al. Transcriptome se­quencing of t!ie naked mole rat ( Heterocephalus glaber% and identification of hypoxia tolerance genes ：[ J ]. Biology Open，2017，6 ( 12 % ： 1904­1912.

[8] Tsai C A，Hsueh H M，Chen J J. Estimation of

false discover rates in multij^le testing ： applica­tion to gene microarray data. [ J ]. Biometrics，2003，59(4 % ： 1071-1081.

[9] Todorov V，Filzmoser P. Robust statistic for the

one - way MANOVA [ J ]. Computational Statis­tics & Data Analysis，2010，(1 % ：37-48.[10]

Storey J D，Tibshirani R. Statistical signifi­cance for genomewide studies [ J ]. Proceed­ings of the National Academy of Sciences of the United States of Amerca，2003，100 (16 % ： 9440-9445.

[11]

Ding L，Hao F，Shi Z，et al. Systems biological responses to chronic perfluorododecanoic acid exposure by integrated metabonomic and tran- scriptomic studies. [ J ]. Journal of Proteome Research，2009,8(6% ：2882-21.

[12]

Organisciak D，Darrow R，Gu X，et al. Genet­ic ，age and light mediated efects on crystallin protein expression in the retina [ J ]. Photo­chemistry & Photobiology，2006，82 ( 4 %： 1088-1096.

[13]

Voorer CE，De Haard - Hoekman W A，Her­mans M M，et al. Differential synthesis of cystallins in the developing rat eye lens [ J ]. Experimental Eye Research，1990, 50 ( 4 % ： 429-437.

26[14]

武汉轻工大学学报2019 年

Ooki K,Amuro N,Shimizu Y,et al. High level expression of rat gamma - D - crystallin in Escherichia coli. [ J ]. Biochimie, 1994,76(5):398-403.

Phylogenetic - based propagation of functional annotations within the Gene Ontology consorti- um[ J]. Briefings in Bioinformatics，2011，12 ( 5) : 449-462.

[15] Pascale G，Livstone M S, Lewis S E，et al.

( 11 )

formation of nitric oxide in endot!ielium-depend- ent ralaxation [ J ]. Biochem Biophys Res Comm，1988，153(3) ：1251-1256.

[6] Tosiiihiko Hirao et al. L - Amino Acids Produc­

tion in Continuous Culture. Fermentation Tech­nologies ： Industrial Applitions. 1990.

[7] Yamasaki R B，Shimer D A，Feeney R E，Color-

imetri determination of arginine residues in pro­teins by p - nitrophenylglyoxal [ J ]. Analytical Biochemistry，1981，111 ： 20 ~ 226.

[8] 张龙翔等，生化实验方法和技术[M]，人民教

参考文献：

[1 ] [2]

Utagawa T. Production of arginine by fermenta­tion' J] J Nutr，2004，134：28S-2857S.Seifer E，Rettura G，Levenson S M et al. Argi­nine ：an essential amino acid for injur - ed rats [J] .Surgery，1978，84(1 )：224.

[3]

Saito H，Trocki 0, Wang S L et al. Metabolic and immune effects of dietary arginine supple­mentation after bum [ J]. Arch Surg，1987，122 (7) :784-7.

[4 ]

Moncada S，Higgs^V. The L - arginine - nitric ox­ide patliway [ J ]. Nengl J Med，1993，329 (27)： 2002-2012.[5]

Richard MJ P，Daryl D R，David SA，et al. L - arginine is the physiological precussor for the

育出版社，1981.

[9] 王小宁等译，R语言实战[M]，人民邮电出版

社，2016.

[10] 姚汝华，微生物工程工艺原理[M]，华南理

工大学出版社，2005.

( 19 )

2013，34(3) ：392-395.

[17]石雪萍，李静，冉建华，等•人参皂苷Rh2调

[15] 张丹丹，黄森，查学强，等.霍山石斛多糖对

人胃癌细胞生长的抑制作用[J] •食品与生 物技术学报，2014,33(5):2-7.

[16] 陈况况，章宏慧，陈健初.芹菜素对癌细胞作

控PI3IKAKT/GSK-3P信号通路诱导人结 肠癌细胞凋亡[J]•中国药理学通报，2017,

33 (1)：114-119.

用机理的研究进展[J] •食品工业科技，