西北林学院学报２０１８，３３（１）：２１１－２１５ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ． １００１—７４６１．２０１８．０１．３５ 苹果树腐烂病菌挥发性代谢产物的分离提取与致病性研究 袁艮霞 ，李思南 ，秦 辰。，王 惠 ，黄丽丽。 （１．西北农林科技大学理学院，陕西杨陵７１２１００；２．西北农林科技大学植物保护学院，陕西杨陵７１２１００； ３．西北农林科技大学农学院，陕西杨陵７１２１００） 摘 要：为了研究苹果树腐烂病菌的致病活性物质，本研究利用ＭＳ液体培养基培养苹果树腐烂病 菌，采用普通蒸馏法用乙酸乙酯作溶剂，收集其培养滤液中的挥发性代谢产物，利用气相色谱质谱 联用仪（ＧＣ—ＭＳ）分离各个成分，将各组分质谱图与数据库标准物质质谱图对比，初步进行结构定 性，用苹果枝条进行致病活性测定。结果表明，苹果树腐烂病菌在发酵过程中产生的２种挥发性物 质的结构分别为异戊醇和２一苯乙醇，这２种物质均对苹果树枝具有致病活性。 关键词：苹果树腐烂病菌；挥发性代谢产物；致病性；ＧＣ—ＭＳ 中图分类号：￥４３６．６１１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１—７４６１（２０１８）０１～０２１１—０５ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｖｏｌａｔｉｌｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｖａｌｓａ ｍａｌｉ ＹＵＡＮ Ｇｅｎ—ｘｉａ ，ＬＩ Ｓｉ—ｎａｎ ，ＱＩＮ Ｃｈｅｎ。，ＷＡＮＧ Ｈｎｉ¨，ＨＵＡＮＧ Ｌｉ—ｌｊ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＡ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ ７１２１００，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＰｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＡ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｇａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ ７１２１００，Ｃｈｉｎａ ３．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ ７１２１００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｖａｌｓａ ｍａｌｉ ｗａｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ＭＳ ｌｉｑｕｉｄ ｍｅｄｉｕｍ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｉｔｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．Ｉｔｓ ｖｏｌａ— ｔｉｌｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ ａｓ ａｂｓｏｒｂｉｎｇ ｓｏｌｖｅｎｔ．Ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｎ— ｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｉｎ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＧＣ—ＭＳ．Ｔｏ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｅａｃｈ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，ｔｈｅｉｒ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄａｔａｂａｓｅ，ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｏｎ ａｐｐｌｅ ｂｒａｎｃｈｅｓ．ＴＷＯ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｗｅｒｅ ３一 ｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎ一１一ｏｌ ａｎｄ ２－ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎ一１一ｏｌ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｂｏｔｈ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ａｐｐｌｅ ｂｒａｎｃｈｅｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｖａｌｓａ ｍａｌｉ；ｖｏｌａｔｉｌｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ；ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ；ＧＣ—ＭＳ 随着苹果种植面积的不断扩大，苹果树腐烂病 日趋严重，已经严重影响到我国苹果产业的进一步 发展。苹果树腐烂病俗称臭皮病、烂皮病、串皮病， 是由黑腐皮壳属真菌（ ｌｓａ ｍａｌｉ）引起的树枝干皮 等［２ ｌｏ］。也有研究表明，苹果树腐烂病菌分泌的蛋 白类物质有致病活性［１ ，但关于其挥发性成分目前 还尚未见研究报道。 本试验对苹果树腐烂病菌的ＭＳ培养滤液中的 挥发性成分进行分离提取和结构定性，以苹果树枝 条为生物测定材料进行致病性检测，初步确定苹果 树腐烂病菌代谢的挥发性成分与致病的关系，以期 为该病菌致病机理的研究提供依据。 层腐烂病害［１］，由于对其致病机理还不十分清楚，导 致对该病的防治比较盲目。要想搞清楚致病机理， 必须对其分泌的致病活性物质进行研究。目前对苹 果树腐烂病菌代谢产物的研究主要集中在酶类物 质、根皮苷的降解产物、异香豆素类物质、有机酸类 收稿日期：２０１７－０３—０２修回日期：２０１７－０５—１３ 基金项目：国家重点研发计划（２０１６ＹＦＤ０２０１１０８）；陕西省科技统筹计划。 作者简介：袁艮霞，女，在读硕士，研究方向：天然产物。Ｅ－ｍａｉｌ：１２２６２０６４７５＠ｑｑ．ｃｏｒｎ ＊通信作者：王惠，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向：天然农用活性物质。Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｈｕｉａｂ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ 黄丽丽，女，硕士，教授，博士生导师，研究方向：植物病害综合防治 Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｉｙｈｕａｎｇｋ＠１６３．ｃｏｒｎ ２１２ 西北林学院学报 １ 材料与方法 １．１ 材料 接口温度２２０℃，扫描质量范围５０￣５００。通过与谱 库标准物质质谱图对照初步确定收集液中各成分的 结构。 １．２．４纯物质对苹果树枝条的致病活性测定方法 １．１．１ 菌株与培养基 苹果树腐烂病菌野生型菌 株Ｏ３—８，由西北农林科技大学植物保护学院果树 病害病原生物学及综合防治研究团队提供，于ＰＤＡ 培养基４＂Ｃ保存。 ＭＳ培养基：取蔗糖５ ｇ，Ｌ一天门冬酰胺２ ｇ，磷 酸二氢钾１ ｇ，七水合硫酸镁０．５ ｇ，七水合硫酸锌 枝条的准备：取粗细和长短相等且长势相近的健 康苹果树枝３Ｏ支，用０．６ 的次氯酸钠溶液浸泡１Ｏ ｍｉｎ进行消毒，然后用无菌水漂洗３次，于超净工作 台上晾干，用石蜡封在形态学上端以防止过多水分 散失，用湿润棉花包裹形态学下端保湿，保证试验过 程中枝条存活。 活性测定：先用灼烧后的打孔器在每个枝条中 ０．８８ ｇ，微量元素：水合铁１．５ ｍｇ，五水合硫酸 锰０．４４ ｍｇ，ＶＨ ０．００５ ｍｇ，ＶＢｌ ０．１ ｍｇ，于１ ０００ ｍＬ 水中，每ｌ ０００ ｍＬ培养基中加１００ Ｌ微量元素， ＰＨ为５～８。 间表面造成伤口，然后分２组处理进行试验，第１组 用微量注射器在枝条伤口处分别滴异戊醇１０“Ｌ和 ２一苯乙醇１０ Ｌ，每个样品处理３个枝条。以未滴加 任何物质的带伤枝条为对照，保存在密封的培养皿 中，在恒温培养室中进行培养，定期观察；第２组在 伤口上除滴加相应待测物质后，再将ＰＤＡ上培养 了３ ｄ的苹果树腐烂病菌野生型菌株０３—８菌饼接 １．１．２ 仪器与试剂 气相色谱一质谱联用仪： ＱＰ２０１Ｖｌｔｒａ型。乙酸乙酯：色谱纯，天津市科密欧 化学试剂有限公司。异戊醇，２一苯乙醇均为市售分 析纯试剂。 １．２方法 １．２．１ 培养滤液的制备 先将菌株０３—８接种至 ＰＤＡ培养基上，于２５℃培养３ ｄ。用直径５ ｃｍ的打 孔器沿菌落边缘打出菌株长势均匀的菌饼接种于 ＭＳ液体培养基中，并设置空白对照，２５℃进行培 养，每天摇瓶１次，培养２Ｏ ｄ。用布氏漏斗抽滤得到 培养滤液。 于伤口处，其余条件保持与第１组一致。置于２５℃ 恒温室中培养，８０ ｈ后进行病斑大小测定。病斑面 积大小以长直径与短直径的乘积表示。 １．２．５数据分析数据处理均经过ＳＰＳＳ（１６．０）软 件进行差异显著性分析，采用ＬＳＤ法。 １．２．２挥发性代谢产物的收集 取上述培养滤液 ３００ ｍＬ于圆底烧瓶中，进行普通蒸馏，用１０ ｍＩ 乙 酸乙酯收集馏分，收集液封口保存于４℃冷藏箱中。 １．２．３挥发性代谢产物的定性分析 取收集液在 如下ＧＣ—ＭＳ条件下进行分析测定，ＧＣ—ＭＳ条件： ２ 结果与分析 ２．１挥发性代谢产物的结构确定 用Ｇｃ＿ＭＳ分别对空白培养基及培养滤液的收 集液进行定性分析得到色谱图（图１）。图１培养滤 液中的２个挥发性组分Ａ和Ｂ的对应质谱图分别 石英毛细管柱（３０．０ ｍ×０．２５ ｍｍ），升温程序６０～ １００℃（１０℃·ｍｉｎ ），１００～２４０ ｏＣ（４￣Ｃ·ｍｉｎ ， 见图２（Ａ）和（Ｂ）中上图，在数据库中发现的与其相 似度最高的相应标准物质质谱图见图２（Ａ）和（Ｂ） 中下图。与谱库中标准物质对比得到的相应挥发性 代谢产物的结构见图３。由图３可知，这２种物质 分别为异戊醇和２一苯乙醇。 ２４０ ｏＣ保留３ ｒａｉｎ），柱流量１．０ ｍＬ·ｍｉｎ～。接口 温度２３０℃外，进样量２ Ｌ，载气Ｈｅ进样方式为不 分流，柱流量１．１１ ｍＬ·ｒａｉｎ ，吹扫流量３ ｍＬ· ｍｉｎ。ＥＩ源，电子能量７Ｏ ｅＶ，离子源温度２００℃， （ｘｌ，０００，ｏｏ０） ｌ ３．０ ２．０ １．Ｏ 气， ＾１ ． ０．０ Ｌ 一 一 ＾．． ． 一 ． ０３．８ ＣＫ ４ ５ ６ ７ ８ ９ ｌ０ ｌｌ １２ １３ １４ ｌ ５ ｌ６ １７ １８ １９ ２０ ２１ ２２ ２３ 图１ 空白培养基及苹果树腐烂病菌０３—８的ＭＳ培养滤液中挥发性代谢物的色谱图 Ｆｉｇ．１ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ ｐｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ＭＳ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｏｆ Ｖａｌｓａ ｍａｌｉ ０３——８ 第ｌ期 袁艮霞等：苹果树腐烂病菌挥发性代埘产：物的分离提取与致病性研究 ２１ ３ ５０ ６（｝ ５ ７（）８（） ９【】 Ｉ（）（Ｊ ｌｌ（１ ｌ ２（） ｌ ３（） ｌ４（） Ｉ ５（Ｊ ｌ ６０ Ｉ ７０ ｌ ８（） Ｉ９（ ７ （】 Ｉ ／Ｘ／ｘ． ０ Ｉ５８ ， ７７ ８ ７ ５（） ６０ ７（） ８（） ９０ ９ ｌ（）（） ｌ】０ ｌ ２（Ｊ ｌ３ ０ ｌ４０ ｌ ５（｝ ｌ６０ ｌ ７【】 ｌ ８０ Ｉ９ ６５ １２２ ｉ ５０ ６３Ｉ ６【） ７（】 ７．７． ｇ７． ． １ ８０ ９０ ９ ｌ２ｌｌ１ 】．３３１＂ １ ５ｌ １６３ １ ７（）ｌ７７ ¨（｝ １ ２（１ ｌ３（） ｌ４０ Ｉ ５（｝ ｌ ６０ ｌ ７Ｏ １ ｇ（｝ ｌ９４ ｌ９（Ｉ ２ Ｈ ｌ（）（） ．５１ ５ｌ６ ６ ７ｌ７ ｇ９ ５（） ６（） ７（） ｇｏ ９０ ｌ（）（１ Ｉ Ｊ（） Ｉ１Ｉｌ２： ｌ ２《） ｌ３《） ｌ４（１ ｌ ５ ０ ｌ ６０ ｌ ７０ ｌ ｇｏ ｌ９０ ２００｛Ｂ） 注：每组 ｌｆ】Ｉ．边为 果树懵烂病菌¨：卜８的ＭＳ培养滤液中挥发性代谢物的质潘罔． 边为数掷 庠 ｝｜相似度最尚的怀准物质硬潜图；Ａ为件 戊醇．Ｈ为？水乙醇 图２ 苹果树腐烂病菌ｌ，３—８的ＭＳ培养滤液中２种挥发性代谢物的质谱图及谱库对比图 Ｆｉｇ．２ Ｌ’【）ｎａｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｉ］［］ＳＳＳ Ｉ）ｔ （、ｔ ｒｆｔ（）ｆ １ＷＯ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｍｃｔ ａ｜）ｏｌｉｔｅｓ ｉｎ ＭＳ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｉｈ ｒ￣ｔｌ（、ｏｆ Ｖ．．ｔａｌｌ ０３ ８ ｗｉｌｈ ｓｔａｎｄａ ｒｄ ｓｐｅｃｔｒａ 人一。Ｈ ～ ａ．ＣＫ 图３苹果树腐烂病菌Ｏ３—８的ＭＳ培养滤液中 ２种挥发性代谢物的结构 Ｆｉｇ．３ Ｓｔ ｒ ＬＩｒＩｌｌ ｒｔ ｓ ｏｆ ｔｗ（）ｖｏｌａｔｉｈ ｎＨ、ｔａｂ｛］ｌｉｔ Ｌ ｉｎ ＭＳ ＣｔｌｈＩＪ１ｔ ｎｌ１ ｒａｔＩ＿Ｊ ｏｆ Ｖ．ｍｄ］ｉ（）：｛８ ｂ－ＣＫ ｂ—ｌ ｂ一２ ２．２异戊醇和２．苯乙醇的生物活－眭 利用苹果枝条作为生测×１ｆ象，检测纯异戊隙和 ２一苯乙醇的牛物活性结果见 ４。『｝ｉ图４町以看¨｛， 注：，卜ｃｋ：伤Ｉ Ｉ术处删 ｒ１：伤ｒ］一＿ｕ 醇 ２：伤Ｉ Ｉ＋２苯乙醇：１）ｃｋ： 伤ｕ＋菌饼： Ｉ：伤ＩＩ 戊醇十菌饼；｝】２：伤Ｉ】 ２笨乙醇 饼。菌饼：苹求倒腐 、 病菌０３ ８菌饼 图４ 异戊醇和２～苯乙醇对苹果树枝条的致病活性测定结果 Ｆｉｇ．４ Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ０Ｉ、ａｐｐｌｅ ｔ Ｆｅｅ ｈｒａｎｃｈ￣、ｓ ｏｆ ３ ｍ（ ｔｈｙｌｈｍａｎ １（１ｌ ａｎｄ ２——ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｕ ｌ ｏｌ ｈｌｃｋ的病斑大小明 ＞ａ ＣＫ，说明小试验使用的苹 果树腐烂病 县有明 的致病性。从罔 【还可以看 ｊｆＩ．ａ ＣＫ枝条Ｌ没有 示病斑． ａ ｌ不１Ｉ ａ ２枝条ｊ 明 有病斑．丧ＩＪ月异 醇和２一笨乙醇均埘苹果树枝 具有致病活性。另外罔４还｛『ｌ；＿示，ｂ一１和ｂ ２与１）一 从表１和表２町以看出， １与ｂ【：Ｋ差异 著， 且ｂ １的病斑明 ＜ｂ一（、Ｋ．表明存加有异戊 醇的枝条伤Ｕ＿ｌ：接０３ ８菌饼，枝条上的病斑不但 没有加强，反而比伤口上直接接闲饼的病斑小；同Ｉｉ１ｆ ＣＫ相比，只仃ｂ－ＣＫ菌丝能够正常生长，而滴７ＪＩ１异 戊醇和２一水乙醇后冉接的菌饼几乎没有菌丝，ｆ Ｋ 的迹象，表【ｉ月这２种化合物对０３—８的牛长具有明 抑制作川。 对网 １ ｔ『ｌ符处理的敛病斑而积夫小进行统汁的 将ａ １和１）１进行比较发现，滴有异 醇的枝条Ｊ 不接菌饼ｆ¨接菌饼产 的病斑大小尤 著性差 。 表明异戊崞的存在抑制了０３—８蔺饼的致病活 。 从表ｌ干¨表２还可以看Ｈ｛．ｈ一２与ｂ ＣＫ差异 结果见表１。对友１巾各组数据进行 著性分析的结 果 表２。发１和表２表明 一】和ａ一２的病斑大小均 与ａ ＣＫ Ｐ一０．０５水平上差芹 著。说明异戊醇和 ２一苯乙醇对苹果树枝条具有明显的致病活性。 显著，似乎意味着存菌饼存在时２一苯乙醇没有 示 ｊ“致病活性Ｅ；但将 ２和ｂ ２进行比较发现，ａ ２和 ｈ ２也无 著性差异，似乎在２一苯 醇存在时菌饼 没有表现ｆ｝｛致病活性。综合分忻认为是２苯乙孵 ２１４ 西北林学院学报 的存在抑制了０３—８菌饼的致病活性。 表１ 苹果枝条接触挥发性代谢物后的病斑面积 Ｔａｂｌｅ １ Ｌｅｓｉｏｎ ｓｉｚｅ ｏｆ ａｐｐｌｅ ｂｒａｎｃｈｅｓ ａｆｔｅｒ ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｏｆ Ｖａｌｓａ ｍａｌｉ 注；ａ—ＣＫ：伤口未处理；ａ一１：伤口＋异戊醇；ａ一２：伤口＋２－苯乙 醇；ｂ－ＣＫ：伤口＋菌饼；ｂ－１：伤口＋异戊醇＋菌饼；ｂ－２：伤口＋２－苯乙 醇＋菌饼。菌饼：苹果树腐烂病菌０３—８菌饼。 表２苹果枝条接触挥发性代谢物后的病斑面积的 显著性分析结果 Ｔａｂｌｅ ２ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｓｉｏｎ ｓｉｚｅ ｏｆ Ａｐｐｌｅ ｂｒａｎｃｈｅｓ ａ｛ｔｅｒ ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｏｆ Ｖａｌｓａ ｍａｌｌ 代号 ａ－ＣＫ ａ一１ ａ一２ ｂ－ＣＫ ｈ １ ｂ一２ ａ—ＣＫ Ａ Ａ Ａ ａ一１ Ａ Ｂ ａ一２ Ａ Ｂ ｂ—ＣＫ Ａ Ａ Ｂ ｂ一１ Ｂ Ａ ｈ一２ Ｂ Ｂ 注：Ａ表示有显著性差异，Ｂ表示无显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０５）。 ３ 结论与讨论 ３．１ 异戊醇和２．苯乙醇是苹果树腐烂病菌的代谢 产物 本试验从苹果树腐烂病菌的发酵液中分离得到 ２个挥发性化合物：异戊醇和２一苯乙醇，为了确认， 试验中同时改变了培养基进行培养，在培养滤液中 也检测到这２种挥发性成分，表明这２种物质是苹 果树腐烂病菌的代谢产物。目前还尚未见到从苹果 树腐烂病菌甚至从其他果树病害的病原菌代谢产物 中分离到这２种物质的报道，仅有从植物及其他微 生物中分离得到这２种物质的报道＿】 。 。 ３．２异戊醇和２．苯乙醇是苹果树腐烂病菌的致病 活性物质 本试验发现异戊醇和２～苯乙醇对苹果树枝条 均有直接的致病活性，表明它们就是苹果树腐烂病 菌的致病活性物质。另外，本试验在进行２种挥发 性物质的生物活性测定中发现，在滴加了异戊醇的 苹果树枝条上接苹果树腐烂病菌的菌饼和不接菌 饼，产生的病斑大小在统计分析时差异不显著。在 滴加了２一苯乙醇的枝条上同样接苹果树腐烂病菌 菌饼，与不接菌饼产生的病斑大小在统计分析时差 异也不显著。表明异戊醇和２一苯乙醇的存在都抑 制了苹果树腐烂病菌的正常致病性。分析认为，这 ２种物质都是苹果树腐烂病菌在对苹果树致病过程 中产生的致病活性成分，由于致病过程中代谢产生 的物质量很少，逐渐进入树体对病原菌本身并无明 显抑制作用，使病原菌可以继续代谢进一步发挥致 病作用。而本试验直接使用了１Ｏ Ｌ纯物质，其浓 度远大于病原菌分泌的量，相当于在生物合成反应 体系中突然出现了大量的产物，抑制了正反应的进 行，因此病原菌分泌异戊醇和２一苯乙醇的反应受到 抑制，也就是病原菌的致病作用受到了抑制。这进 一步佐证了异戊醇和２一苯乙醇是苹果树腐烂病菌 的致病活性物质这一论点。 这一点在之前的文献中也尚未见报道，只有一 些关于异戊醇和２一苯乙醇作为香气成分的报 道￣１５ １７］。 ３．３异戊醇和２．苯乙醇具有抑菌活性 本试验发现在苹果树枝条上滴加了异戊醇或 ２一苯乙醇后再接腐烂病病原菌时，该菌不但不能致 病，而且没有了生长的迹象，表明这２种物质在１Ｏ Ｌ的量上就可以抑制该菌的生长。关于苯乙醇的 抑菌活性曾有报道。陈利军ｌ＿１胡等分析了１株分离 自淡竹的产香真菌蒙塔涅梨孢假壳的挥发物成分， 发现其能够不同程度地抑制５种植物病原真菌的生 长，其中主要成分为苯乙醇，说明苯乙醇本身具有抑 菌作用。 ３．４异戊醇可能是苹果树腐烂病菌致病过程中产 生的中间体 在进行２种挥发性物质的活性试验中发现，在 滴加纯异戊醇的枝条上接苹果树腐烂病菌菌饼，其 病斑比直接接菌饼反而小，分析认为可能是本试验 使用的异戊醇的浓度过高抑制了苹果树腐烂病菌的 正常生长。另外，黄丹『１ 等从浓香型大曲中分离得 到一株产酯化酶霉菌，鉴定为黄曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）通过ＧＣ—ＭＳ对其代谢产物分析发现其中 含有异戊醇及２一苯乙醇，随着时间的延长，这２种化 合物会逐渐转化为对应的酸及酯，其代谢产物的合 成大致呈醇一酸一酯的变化规律。对从中分离到的细 菌嗜热葡糖苷酶芽胞杆菌的发酵液进行分析，也发 现随着培养时间的延长，异戊醇等各种高级醇逐渐 减少甚至消失，而酯类物质则逐渐增加 。张静Ｌ２ 等通过ＳＰＭＥ－ＧＣ－ＭＳ测定不同品种牡丹花在３个开 花时期的挥发性物质成分，发现花蕾期以醇类为主， 盛花期和衰花期酯类物质含量均增加。联系到苹果 树腐烂病菌培养后期散发出特殊的气味，因此推测， 在含有低浓度异戊醇时，苹果树腐烂病菌能够利用异 戊醇合成其他的代谢产物，而当异戊醇浓度达到一定 的限度后就会抑制相应的反应。至于这２种挥发性 第１期 袁艮霞等：苹果树腐烂病菌挥发性代谢产物的分离提取与致病性研究 ２１５ 物质在苹果树腐烂病菌中的代谢途径及其在致病机 ｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ 理中的作用还有待进一步的研究及验证。 参考文献： ［１］ＷＡＮＧ ｘ，ＷＥＩ Ｊ，ＨＵＡＮＧ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｒｅ—ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏ ｇｅｎｓ ｃａｕｓｉｎｇ Ｖａｌｓａ ｃａｎｋｅｒ ｏｎ ａｐｐｌｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ＥＪ］．Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ， ２Ｏ１１。１Ｏ３（２）：３１７． Ｅ２］刘福昌，李美娜，王永淦．苹果树腐烂病菌致病因素一一果胶酶 的初步探讨ｆＪ］．中国果树，１９８０（４）：４６—４８． ［３］王娟，马强，庄霞，等．苹果腐烂病病原菌分泌物中果胶酶的测 定［Ｊ］．内蒙古农业科技，２００９（４）：３９—４０． ＷＡＮＧ Ｊ，ＭＡ Ｑ，ＺＨＵＡＮＧ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｃｔｉ— ｎａｓｅ ｉｎ ｆｕｎｇｉ ｓｅｓｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｐｌｅ ｔｒｅｅ ｃａｎｋｅｒ Ｉ－Ｊ１．Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９（４）：３９—４Ｏ．（ｉｎ Ｃｈｉ— ｎｅｓｅ） ［４］王建华，柯希望，黄以超，等．苹果树腐烂病菌发酵液中根皮苷 主要降解成分的分析［Ｊ］．西北农林科技大学学报：自然科学 版，２０１２（８）：８９—９４． ＷＡＮＧ Ｊ Ｈ，ＫＥ Ｘ Ｗ，ＨＵＡＮＧ Ｙ Ｃ，ｅｔａ１．Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｖａｌｓａ ｍａｌｌ ｖａｒ．ｍａｌｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｌｉｑｕｉｄ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｐｈｌｏｒｉｚｉｎ ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．，２０１２ （８）：８９－９４．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［５］何嫒嫒，于哲，王海英，等．不同碳氮源对苹果腐烂病菌胞外果 胶酶活性的影响［Ｊ］．西北农林科技大学学报：自然科学版， ２０１４（１１）：８１—８６． ＨＥ Ｙ Ｙ，ＹＵ Ｚ，ＷＡＮＧ Ｈ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｒｂｏｎ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｅｃｔｉｎａｓｅ ｏｆ Ｖａｌｓａ ｍａｌｌ ｖａｒ．ｍａｌｉ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ— ｔｙ：Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．，２０１４（１１）：８１－８６．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［６］柯希望．苹果树腐烂病菌在树皮组织内的扩展观察［Ｄ］．陕西 杨陵：西北农林科技大学，２００９． ［７］ＮＡＴＳＵＭＥ Ｈ，ＳＥＴＯ Ｈ，ＯＴＡＫＥ Ｎ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ａｐｐｌｅ ｃａｎｋｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｅ ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｔｏｘｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｖａｌｓａ ｃｅｒａｔｏｓｐｅｒｍａ ［Ｊ］．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ＆Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８２，４６（８）：２１０１— ２１０６． ［８］ ＫＯＧＡＮＥＺＡＷＡ Ｈ，ＳＡＫＵＭＡ Ｔ．Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎ ｉｎ ｓｙｍｐｔｏｍ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｙ Ｖａｌｓａ ｃｅｒａ— ｔｏｓｐｅｒｍａ［Ｊ］．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏ１ｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｊａ— ｐａｎ，１９８２，４８（４）：５２１—５２８． ［９］ＴＲＡＱＵＡＩＲ Ｊ．Ｏｘａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｏｘａｌａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｌｅｕｃｏｓｔｏｍａ ｃｉｎｃｔａ ａｎｄ Ｌ．ｐｅｒｓｏｏｎｉｉ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎ ｐｅａｃｈ ｂａｒｋ ｔｉｓｓｕｅｓ［Ｊ］．Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ，１９８８，６５（９）：１９５２— １９５６． ［１Ｏ］ＳＶＩＲＣＥＶ Ａ Ｍ，ＢＩＧＧＳ Ａ Ｒ，ＭＩＬＥＳ Ｎ Ｗ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｒ— ｔｉｍ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｔｏｔｏｘｉｎｓ ｆｒｏｍ ｌｉｑｕｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｃａｎａ— ｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ。１９９１，６９（９）：１９９８—２００３． ［１１］王建华．苹果树腐烂病菌致病物质的初步研究［Ｄ］．陕西杨 陵：西北农林科技大学，２０１２． Ｅ１２］祝云飞，黄治国，邓杰，等．浓香型大曲中一株酵母菌的分离鉴 定及其挥发性产物分析［Ｊ］．四川ｉ理工学院学报：自然科学版， ２０１６，２９（１）：７－１１． ［１３］ 白岩岩，贾薇，张劲松．樟芝发酵液挥发性物质提取方法及成 分比较［刀．食品科学，２０１３，３４（２４）：１６３—１６７． ＢＡＩ Ｙ Ｙ，ＪＩＡ Ｗ，ＺＨＡＮＧ Ｊ Ｓ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘ— ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ ｏｆ Ｔａｉｗａｎｏｆｕｎｇｕｓ ｃｏｍｐｈｏｒａｔｕｓ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４（２４）：１６３—１６７．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［１４］王丽娟，刘苏萌，楚明忠．百合产香内生真菌的分离鉴定及其 挥发性成分分析［Ｊ］．食品工业，２０１３（９）：２０３—２０５． ＷＡＮＧ Ｌ Ｊ，ＬＩＵ Ｓ Ｍ，ＣＨＵ Ｍ Ｚ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｆｒｏｍ Ｌｉｌｉｕｍ Ｓｉｂｅｒｉａ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，２０１３（９）：２０３—２０５．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） －１１５］谷运璀，宦月琴，钱莉群，等．天然肉桂酸及其酯类的制备［Ｊ］． 香料香精化妆品，２０１３（Ｓｕｐｐ．１）：３６—３８． ＧＵ Ｙ Ｃ，ＨＵＡＮ Ｙ Ｑ，ＱＩＡＮ Ｌ Ｑ，ｅｔａ１．Ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｎａｔ— ｕｒａｌ ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｓｔｅｒｓ［刀．Ｆｌａｖｏｕｒ Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ｃｏｓ～ ｍｅｔｉｃｓ，２０１３（Ｓｕｐｐ．１）：３６—３８．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［１６３晏慧君，王娟，陈敏，等．朋粉（Ｒｏｓａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ‘Ｐａｌｉｉｄａ’）、大马 士革蔷薇（Ｒ．ｄａｍａｓｃｅｎｅ）、百叶蔷薇（Ｒ．ｃｅｎｔｉｆｏｌｉａ）香气成分 分析［Ｊ］．云南农业大学学报：自然科学，２０１７，３２（１）：７８—８２． ＹＡＮ Ｈ Ｊ，ＷＡＮＧ Ｊ，ＣＨＥＮ Ｍ， ａ１．Ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｃｅｎｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ Ｒｏｓａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ‘Ｐａｌｌｉｄａ’，Ｒ．ｄａｍａｓｃｅｎｅ ａｎｄ Ｒ．ｃｅｎｔｉｆｏｌｉａ ｂｙ ＧＣ／ＭＳ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７，３２（１）：７８—８２．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［１７］曹建宏，张振文，张莉，等．霞多丽干白葡萄酒香气成分的 ＧＣ／ＭＳ分析口］．西北林学院学报，２００６，２１（４）：１３２—１３４． ＣＡＯ Ｊ Ｈ，ＺＨＡＮＧ Ｚ Ｗ，ＺＨＡＮＧ Ｌ，ｅｔａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｏｍａ ｃｏｒｎ～ ｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ ｄｒｙ ｗｈｉｔｅ ｗｉｎｅ ｂｙ Ｃ－Ｃ／ＭＳ ｒＪ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００６，２１（４）：１３２—１３４．（ｉｎ Ｃｈｉ— ｎｅｓｅ） ［１８］ 陈利军，王国君，田雪亮，等．产香真菌ＺＹ－２菌株鉴定及其挥 发性物质抑菌活性测定与组分分析［Ｊ］．南方农业学报，２０１３， ４４（１１）：１８１８—１８２２． ＣＨＥＮ Ｌ Ｊ，ＷＡＮＧ Ｇ Ｊ，ＴＩＡＮ Ｘ Ｌ， ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｒｏｍａ——ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｆｕｎｇｕｓ ＺＹ—。２ ａｎｄ ｉｔｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，２０１３，４４（¨）：１８１８—１８２２．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［１９］黄丹，方春玉，尚志超，等．一株酯化酶霉菌的分离、鉴定及代 谢产物特征［Ｊ］．中国酿造，２０１０，（６）：６２—６４． ＨＵＡＮＧ Ｄ，ＦＡＮＧ Ｃ Ｙ，ＣＨＵ Ｚ Ｃ，ｅｔａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉ— ｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｓｔｅｒａｓｅ—ｐｒｏｄｕｃｅ ｍｏｕｌｄ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ０ｆ ｉｔｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎａ Ｂｒｅｗｉｎｇ，２０１０（６）：６２—６４．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［２０３黄丹，方春玉，储玉龙，等．一株酯化酶细菌的分离、鉴定及代 谢产物特征［Ｊ］．四川理工学院学报：自然科学版，２０１０（３）： ３２１－３２３． ＨＵＡＮＧ Ｄ，ＦＡＮＧ Ｃ Ｙ，ＣＨＵ Ｙ Ｌ， ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒ— ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｅｓｔｅｒｉｆｙｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８Ｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｎａｔ— ｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０（３）；３２１－３２３．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［２１］张静，周小婷，胡立盼，等．ＳＰＭＥ—ＧＣ—ＭＳ测定不同品种牡丹 花挥发性物质成分分析［Ｊ］．西北林学院学报，２０１３，２８（４）： １３６－Ｉ４３． ＺＨＡＮＧ Ｊ，ＺＨ０Ｕ Ｘ Ｔ，ＨＵ Ｌ ｐ， 口Ｚ．ＳＰＭＥ—ＧＣ—ＭＳ ｍｅａｓ— ｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｅｏｎｙ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１３，２８（４）：１３６—１４３．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）
