实验方案

一、 分离培养基

高氏一号培养基：可溶性淀粉14g， KNO30.7g ， Nacl 0.35g， K2HPO43H2O 0.35g ， MgSO4.7H2O 0.35g ， FeSO4.7H2O 0.007g， 琼脂粉9.1g ， 水700mL ， pH7.0～7.4。

腐殖酸培养基：腐殖酸0.7g，KCl 1.19g MgSO4 .7H2O,0.35g，Na2HPO4 0.35g CaCO3 0.014g，硫酸亚铁0.007g，复合营养素2.625mg（0.002625g）（硫胺素0.5mg，烟酸0.5mg，泛酸0.5mg 对氨基苯甲酸0.5mg，核黄素0.5mg 维生素B6 0.5mg，肌醇0.5mg，生物素0.25mg） 琼脂粉9.1g，水700mL，pH7.2。

HVG培养基：腐殖酸0.7g，KCl 1.19g MgSO4 .7H2O 0.35g，Na2HPO4 0.35g，硫酸亚铁0.007g,CaCl20.014g,琼脂粉9.1g，复合营养素2.625mg，水700ml， pH7.2。

葡萄糖-天门冬素琼脂培养基：葡萄糖7g，天门冬素0.35g ，牛肉膏1.4g，硫酸铵0.35g，磷酸氢二钾0.35g，琼脂粉9.1g，水700ml，pH7.2。 二、 抑制剂

2ug/mL青霉素，75ug/mL重铬酸钾，0.02mg/mL萘啶酮酸， 三、 所用仪器及数目 试管—稀释土样用：用4+1只。

培养皿—36只；4（培养基）×3（梯度）×3（平行）。 吸管—6只1ml。

三角瓶—装培养基250ml的28只，装无菌水250ml的2只。 头—5ml的10只，1ml一盒。涂布棒5只。 四、 实验步骤

1、配制培养基：分别配制四种培养基1000ml，分装于三个250ml三角瓶中各100ml，剩余的灭菌后贴标签保存。

2．重铬酸钾抑制剂配制：浓度75ug/mL；即每100ml培养基中添加7.5mg重铬酸钾；在50ml的水中加入375mg的重铬酸钾，配成7.5mg/ml，再在100ml培养基中加1ml的7.5mg/ml的溶液。

3、 一三角瓶中加入9ml水（土壤稀释10-1），另一瓶子加入50ml水。将培养基及其所用仪器进行灭菌。

4、土壤预处理

称取1g土样，在110℃下加热1h,加入9mL无菌水制成土壤悬浮液，加入1.5%（w）苯酚(10ml中加0.15ml)，40℃振荡20min。 5、添加抑制剂；

①0.02mg/mL萘啶酮酸配制，在20ml无菌水当中加入40mg萘啶酮酸配成2mg/ml的溶液，再在100ml培养基中加1ml配制的溶液。

②青霉素配制：2ug/mL青霉素,20ml无菌水中加入4mg的青霉素配成0.2mg/ml的溶液，再在100ml培养基中加入1ml配制的溶液。

6、倒平板

在每个培养基中添加上述三种抑制剂后混匀，倒平板，每种培养基倒9个平板，每个平皿中倒20ml左右。

7、涂布培养：分别吸取0.2ml的10-3的土壤悬液，在三个培养皿上涂布均匀，做标签。10-4、10-5方法同上。在28℃的恒温培养箱中培养14d.

8．观察生长情况并记录填下表

表1不同培养基中稀有放线菌生长情况对比

培养基 浓度 菌落数目 菌落形态 生 10-3 10-4 10-5 10-3 10-4 10-5 10-3 10-4 10-5 10-3 10-4 10-5 高氏一号培养基 腐殖酸培养基 葡萄糖天门冬氨HVG培养基 酸培养基 长情况 其他

表2 4种培养基分离微生物的效果比较 培养基 总菌落中放放线菌中线菌比例 链霉菌比例 高氏一号培养基 腐殖酸培养基 葡萄糖-天门冬素琼脂培养基 HVG培养基

9、挑出稀有放线菌，并纯化培养，插片培养后在电镜下观察菌丝及菌落形态。

表3电镜下观察稀有放线菌的形态特征

培养特征 针叶林土 菌丝 阔叶林土 田土 稀有放线菌出菌率 鉴定分类 其他 在不同培养基上稀有放线菌生长情况 高氏一号 培养基上 生长情况 腐殖酸培 养基上生长情况 葡萄糖— —天冬氨酸培养基 HV培养 基

备注：用上述方法将三种土样分批分离，先做针叶林土壤，后做田土、阔叶林土壤。