动物检疫学讲义

第一节动物检疫概述

一、动物检疫的定义动物检疫（quarantine）是遵照国家法律，运用强制性手段和科学技术方法对动物、动物产品、运载工具等进行疫病方面的检查，并采取相应措施预防或阻断动物疾病的发生、流行以及从一个地区向另一个地区之间的传播。三、动物检疫的意义和作用1.保护动物生产2.促进经济贸易活动的开展3.保护人类健康4.保障消费者使用合格的动物及动物产品四、动物检疫的基本属性1.法制性2.预防性3.国际性4.综合性五、动物检疫的内容（一）检疫性疫病动物检疫实质是检出引起动物疾病特别是传染病、寄生虫病的病原体以及其他有害生物。（二）检疫物1、动物、动物产品和其他检疫物2、运载工具和器物其他检疫物包括动物血清、动物废弃物（分泌物、排泄物、渗出物以及脱落的皮屑、毛发等）、动物疫苗、动物饲料等。六、动物检疫法规（一）主要国际动物检疫相关组织及法规1、相关组织：有世界贸易组织（WTO）和国际兽疫局（OIE）。2、主要法规：与动物检疫相关的国际性法规主要有《SPS协定》和《国际动物卫生法典》。（二）中国有关动物检疫法规目前，主管我国动物检疫的国家机关是国家质量监督检验检疫总局和农业部，涉及我国动物检疫的主要法规包括《中华人民共和国动物防疫法》、《中华人民共和国进出境动植物检疫法》、《中华人民共和国进出境动植物检疫法实施条例》、《中华人民共和国禁止携带、邮寄进境的动物、动物产品和其它检疫物名录》、《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》等。第二节动物检疫的类型

一、产地检疫（quarantineinoriginarea）：指动物及动物产品在其生长或生产期间于原产地进行的检疫。1.收购检疫：指养殖户、农牧埸以及规模养殖集团的动物、动物产品形成贸易规模时，由购销单位和当地检疫部门配合进行的检疫检查。2.屠宰检疫：指对动物在屠宰前后进行的检疫检验。一般分为宰前检疫和宰后检疫两类。3.市场检疫：指对集贸市场交易、出售的动物和动物产品进行检疫检查。二、运输检疫（transportquarantine）：指动物和动物产品等检疫物起运前由相关检疫机构进行的检疫检查。1.托运检疫：指检疫部门对托运的动物和动物产品等检疫物进行的检疫检查2.交通要道检疫：指在交通要塞和起运频繁的车站、码头、港口等地段设立检疫消毒站，对运输的动物、动物产品进行检疫，并查验有关检疫单证。对检疫不合格的动物和动物产品等，就地依法进行检疫处理。三、隔离检疫（isolationquarantine）：指将输入或输出的动物在检疫机关指定的隔离场所内，于隔离条件下进行饲养，并在一定的观察期内进行疫病检查、检测和处理的检疫措施。1.隔离检疫场：一般分国家级隔离检疫场所和地方隔离检疫场所。国家级隔离检疫场所通常由国家进出境动物检疫机关设立，主要针对国境检疫中高风险及中风险的动物疫病。2.地方级隔离检疫场：所通常由地方检疫部门或货主设立，主要针对国内检疫中的动物。进境动物的隔离检疫时间依动物种类而定，一般进境的大中家畜和野生偶蹄类动物需45天，进境小动物或其它动物需30天。四、国境检疫（territoryquarantine）：又称进出境检疫或口岸检疫，是由国家检疫机构对进出国境的动物、动物产品进行的检疫。1、进境检疫：包括进境动物检疫和进境动物产品检疫。是对动物、动物遗传物质和其他生物资源进行的检疫。3、过境检疫：过境检疫是指由输出国运输至输入国的动物、动物产品等检疫物途经第三国时，第三国口岸检疫机构对运输动物、动物产品和运载工具等实施的动物检疫。2、出境检疫：出境检疫包括出境动物检疫和出境动物产品检疫。出境动物检疫是指对输出到其他国家和地区的种用、肉用或演艺用等饲养或野生的活动物出境前实施疫。五、检疫监管（quarantinesupervision）：是检验检疫监督管理的简称，是指检疫机关对输入、输出的动物、动物产品的养殖、生产、加工、存放、转运等过程实施监督管理的检疫措施。（一）检疫监管的内容1、进出境动物的检疫许可、检疫申报、产地检疫、运输检疫和隔离检疫监管。2、批准引进的禁止进境检疫物的运输、使用、存放等过程监管。3、进出境肉类制品、肠衣、奶制品的加工、存放、转运等过程监管。4、进出境生皮张、生毛类等产品的生产、加工、运输等过程监管。5、国际展览会或博览会期间，参展的动物和动物产品等检疫物的检疫监管。6、过境活动物的检疫许可、检疫申报、运输过程等检疫监管。（二）检疫监管的主要措施1、实行注册登记制度2、实行动物检疫过程监管3、建立检疫监管库区4、进行防疫检疫培训5、进行疫情监测六、电子检疫监管：是运用现代质量管理理论和网络信息技术，借助公共网络资源，通过数据资料和视频信息的实时监控，实现动物和动物产品从生产过程到销售利用等环节中检疫申报、风险分析、过程监督、项目检测、符合验证和检疫放行等监督管理的电子信息化系统。第三节动物检疫的风险分析

一、检疫风险（quarantinerisk）：指动物疫病病原体、有毒有害物质随动物、动物产品等检疫物由输出地传入输入地的可能性及其对输入地生产、环境和公共卫生造成的潜在危害。二、风险分析（riskanalysis）将风险识别、风险评估、风险管理和风险交流的一系列活动。三、风险分析的步骤1.风险识别：指确定进境动物、动物产品等可能传入病原体及有毒有害物质的过程。在贸易流通过程中影响疫病传播、流行的因素主要：（1）疫病因素（2）动物防疫体系：主要由兽医机构及人员、动物防疫检疫立法、动物疫病控制计划和动物防疫措施的实施及监督等构成。（3）区域及地区划分①区域划分：在一个国家，为了控制某种重大动物疫病，对于发生疫病的地区及其周围不同距离的地区划分成不同的区域实施分类管理，称为区域划分（zoning）。一般以疫病所在地为中心向外划分为5个区域，从外向内依次为不使用疫苗接种的非疫区、不使用疫苗的监测区、接种疫苗的非疫区、受威胁区、疫区。②地区划分：有相同或相近的动物卫生状况和疫病控制措施的邻近国家或几个国家或其部分地区在某种疫病防疫上可以作为一个地区来对待。2、风险评估是对风险因素及其发生的概率、危害的客观估计。分为：A．定性风险评估：指用如高、中、低或极低等定性术语表示风险发生的可能性或带来后果的严重性的方式。B．定量风险评估是指用数据或概率等定量术语表示风险分析结果的方式。（1）风险评估的原则主要有：①信息和资料应体现科学性、完整性和可靠性。②定性分析和定量风险应有机结合。③评估过程应体现公正性、透明性和一致性，保证公平、合理并易为有关各方理解、认同。④明确不确定事项、假设及其对最后评估结果的影响。（2）风险评估的过程①释放评估（releaseassessment）：揭示引入某种动物和动物产品等检疫物向某一特殊环境释放危害（如病原体等）的风险，评价相关的生物学因素、防疫体系因素和贸易流通因素对释放的影响，定性分析释放事件发生的可能性，定量计算释放事件发生的概率。②暴露评估（exposureassessment）：阐明输入地或进口国的人和动物暴露或接触风险源释放危害（如病原体等）的风险，评价相关的生物学因素、暴露因素、环境气候因素、人文习俗因素和贸易流通因素对暴露或接触的影响，定性分析暴露或接触事件发生的可能性，定量计算暴露或接触事件发生的概率。3后果评估（consequenceassessment）○：确定输入地或进口国的人和动物暴露或接触风险源释放的危害（如病原体等）所引起的潜在后果，定性分析引发潜在后果的可能性，定量计算引发潜在后果的概率。动物检疫实践中，风险源释放危害（如病原体等）所引发的后果一般分为直接后果和间接后果两类。④风险计算（riskestimation）：对释放评估、暴露评估和后果评估的风险结果进行评定。3、风险管理：指对引进某种动物及动物产品等检疫物的风险得出结论、制定防范风险的决策并实施减少或避免风险措施的过程。风险管理由风险评价、方法评价、实施、监管及审查等过程组成。4、风险交流：指风险管理者、风险评估者及社会相关团体、公众之间对风险识别、评估、管理等方面的信息进行交流的过程。第四节动物检疫的基本程序

动物检疫程序（quarantineprocedure）一般包括检疫审批、检疫申报、检疫实施、检疫处理以及检疫放行等5个环节。一、检疫审批（quarantinepermit）又称检疫许可，是在引进动物、动物产品、种质材料等检疫物时，引进单位或个人向检疫机关提前提出申请，检疫机关审查并决定是否批准引进的检疫程序。1、意义：（1）避免盲目引进，减少经济损失（2）提出检疫要求，预防疫病传入（3）签订贸易合同，依法进行索赔2、类型：依据检疫许可物的范围，分为一般审批和特殊审批。在特殊审批中，检疫许可物主要包括以下4类：（1）动物病原体（包括虫种、菌种和毒种等）、害虫及其他有害生物。（2）某种动物疫病流行的国家或地区的相关动物、动物产品、动物种质材料等检疫物。（3）动物尸体、动物标本等。（4）土壤。3、检疫许可的基本手续（1）领取单证（2）报请批准（3）批准发证二、检疫申报：简称报检，是检疫物输入或输出时由货主或代理人向检疫机关及时声明并申请检疫的检疫程序。在进出境动物检疫中，下述4类检疫物需进行检疫申报：①输入、输出的动物、动物产品及其他检疫物。③承运动物、动物产品及其他检疫物的装载容器、包装物。③来自流行某种疫病疫区的运输工具。④过境的动物、动物产品及其他检疫物。1、报检机关：各口岸出入境检验检疫局和各地区动物卫生监督机构。2、检疫申报的基本手续：报检员首先填写报检单然后将报检单、检疫证书（由输出国家或地区的官方检疫机关出具）、产地证书、贸易合同、信用证、等单证一并交检疫机关审验。某些检疫物需要提前进行检疫申报。种用大动物及其精液、胚胎需提前30天报检，小动物等需提前15天报检。三、检疫实施（一）现场检疫：是检疫人员在现场环境中对输入或输出的检疫物进行查验、检查和抽样，并初步确认是否符合相关检疫要求的检疫程序。（二）实验室检验：是指借助实验室仪器设备，利用一定检测方法对现场抽取的检疫物样品进行动物疫病病原体等有害生物检查、鉴定和证实其存在的检疫程序。（三）隔离检疫四、检疫处理：是检疫机关依据检疫法规和检疫要求，根据现场检疫和实验室检验的结果，对检疫物实施退回、销毁或无害化处理的检疫程序。1、检疫处理的方式：检疫处理的方式包括消毒、退回、封存、扑杀、销毁、除害处理、不准入境、不准出境和不准过境等。2、无害化处理：简称除害处理，是指用物理学、化学和生物学等方法处理携带或疑似携带病原体的动物尸体、动物产品等检疫物，以达到消灭传染源、切断传染途径、破坏毒素和消除有害物质的检疫措施。五、检疫放行：是检疫机关根据检疫结果或无害化处理的程度，认为检疫合格后，签发检疫证书、消毒证书、检疫放行单等相关单证并准予出境、入境或过境的检疫程序。第五节动物检疫检验样品

一、检疫检验样品的定义取自动物、动物产品等检疫物或环境，拟通过检验检查反映动物个体、群体、动物产品等检疫物或环境有关检疫状况的材料或物品称为检疫检验样品。二、检疫检验样品的种类1、动物组织样品：心、肝、脾、肺、肾、脑、肠、淋巴结、皮肤、血液等。2、动物废弃物样品：包括动物的各种排泄物、分泌物和渗出物。3、生殖系统样品：主要包括动物死胎、流产胎儿、胎盘、阴道分泌物。4、动物种质材料：主要指动物精液和胚胎。5、动物产品样品：主要包括胴体、食用内脏、食用骨血、原毛、皮张、骨头、蹄角等。6、其他检疫物样品：主要包括动物饲料、空气、土壤、水源、垫料、媒介昆虫等。三、样品采集的一般原则1、及时采样：采集病原分离的样品时，须在病初发热期或症状典型时采集。一般采集未经治疗动物的样品；对濒死期动物，可扑杀采样；患传染性疾病死亡的动物，尽可能立即采样（一般在6小时以内）。2、合理采样：不同疫病的需检样品各异，尚不能确定为何种疫病时，则应全面采样。3、典型采样：采样时，尽可能选取症状典型的病例和病变明显的组织器官。4、无菌采样：避免环境中的微生物污染样品，同时防止样品中的病原体逸撒至周围环境。5、适量采样：采集样品的量要满足检疫检验的需要，留足复检时使用的样品。6、安全采样：采样过程中，一要做好采样人员的安全防护；二要防止造成病原体污染环境或逸撒扩散，以防止疫病的传播和蔓延。7、正确盛样：采集时应一种样品一个容器，容器须完整无损，密封且不渗漏液体。8、迅速送样：微生物检查的样品要求在冷藏条件24小时内送达实验室；病毒学检验的冷藏处理样品，应尽可能在数小时内送达实验室。经冻结的样品须在24小时内送到。四、样品采集及注意事项1、血液样品：血液样品应在动物病畜体温升高或发病期及未经药物治疗期间采集。一般用灭菌注射器和真空采血管采集血样。2、皮肤样品：可用灭菌的器械取病变部位及与之交界的小部分“健康”皮肤；活动物的病变皮肤如水泡皮、结节、痴皮等可直接剪取或刮取。3、排泄物、分泌物和渗出物：眼、口腔、鼻腔、阴道分泌物或渗出液，以灭菌棉拭子蘸取；咽喉食道分泌物，可用食道探子从已扩张的口腔伸入咽喉、食道处反复刮取；皮下水肿液和关节囊（腔）渗出液，用注射器从积液处抽取；胸腔、腹腔渗出液，可在相应部位刺入抽取；作病原菌检验的脓汁应在药物治疗之前采集。4、其他组织样品第二章动物临床检疫

第一节

临床检疫方法和设备

一、临床检疫步骤：先进行大群检疫从大群动物中检出患病动物或可疑动物，进行个体检疫。二、临床检疫的方法：“看、听、摸、检”三、临床检疫的三大环节1、运动时的检查2、休息时的检查3、摄食饮水检查四、临床检疫设备1、猪群检疫设备：测温小圈、测温挡板、测温夹道2、牛群检疫设备：排队保定设备、检疫夹道3、羊群检疫设备：检疫夹道4、家禽检疫设备：检疫飞沟、检疫障板第二节猪临床检疫

一、猪大群检疫：1、运动状态检查2、休息时的检查3、摄食饮水检查二、猪的检温：正常体温38~39.5三、猪个体检疫：着眼点为精神外貌、姿态步样、眼、鼻、口腔及咽喉、被毛及皮肤、肛门及排泄物、摄食及饮水以及体温的变化等。第三节牛临床检疫

一、牛大群检疫：观查牛的鼻镜、鼻孔、嘴角、眼、呼吸及反刍情况二、牛的检温：正常体温37.5~39.5三、牛的个体检查：精神外貌、姿态步样、被毛皮肤、可视粘膜、口鼻体温四、羊的检温：正常体温38.5~40.5第四节家禽临床检疫

看嗉囊有无异常，鸡的正常体温40~42.5，鸭41~43，鹅40.5~42第三章病理学检疫方法

第一节

动物尸体剖检概述

病理学检疫通常分为动物尸体剖检检查和病理组织学检查。一、尸体变化1、尸冷：是指动物死亡后，尸体温度逐渐降低至环境温度的现象。2、尸僵：动物死亡后，最初由于神经麻痹，肌肉失去紧张力而变松弛柔软，但经过很短时间后，肢体的肌肉即行收缩变为僵硬，四肢各关节不能伸屈，使尸体固定于一定的形状。3、尸斑：动物死亡后，由于心脏和大动脉管的临终收缩及尸僵的发生，将血液排挤到静脉系统内，并由于重力作用，血液流向尸体的低下部位，使该部血管充盈血液。4、血液凝固：动物死后不久，在心脏和大血管内的血液即凝固成块，由于败血病、窒息及一氧化碳中毒等死亡的动物，往往血液凝固不良。5、尸体自溶与尸体（1）尸体自溶：是指体内组织受到酶（细胞本身的溶酶体酶、胃液、胰液中的蛋白分解酶等）的作用而引起的自体消化过程。自溶表现最明显的是胃和胰腺。（2）尸体：是指尸体组织蛋白由于细菌作用而发生分解现象。在过程中，并产生大量气体，如氨、二氧化碳、甲烷、氮、硫化氢等。尸体可表现以下几个方面的变化：1)死后臌气：胃肠道表现明显。2)肝、肾、脾等内脏的：表现为肝脏体积增大，质地变软，色泽污灰，肝包膜下可见到小气泡，切面呈海绵状，从切面可挤出混有泡沫的血水，这种变化称为泡沫肝。3)尸绿：出现是由于组织分解产生的硫化氢与红细胞分解产生的血红蛋白和铁相结合，形成硫化血红蛋白和硫化铁，致使组织呈污绿色，这种变化在肠道表现得最为明显。4)尸臭：尸体过程中产生大量带恶臭的气体，如硫化氢、乙硫醇、甲硫醇、氨等，致使的尸体具有特殊的恶臭气味。二、尸体剖检注意事项尸体剖检前，应先了解动物所在地区疾病的流行情况、生前病史、饲养管理等，仔细检查尸体体表特征，如果发现可疑炭疽病例时，应先采取尸体末梢血液作涂片染色检查，在猪，则作下颌淋巴结涂片染色检查，确诊炭疽时，应禁止剖检，同时应将尸体和被污染的场地、器具等进行严格消毒和处理。1、剖检人员的防护：如血液或其他渗出物溅入眼内，可用硼酸水充分冲洗。2、尸体消毒和处理：2米坑掩埋，上覆生石灰和漂白粉。3、尸体剖检记录：专门一位负责详细记录。三、病理材料的采取和寄送1、病原学检验材料采取和寄送：在采取病料前，先将尸体体表用2%臭药水或2%来苏儿消毒，再剖开体腔，以无菌操作采取所需要组织，放在预先灭菌的容器内。2、血清学检验材料的采取和寄送：采取静脉或心脏血，凝固后血清检测抗体。3、中毒材料的采取和专送：采集大量的血液和较多的胃、肠内容物，收集膀胱内尿液，可疑的饲料，大块肝脏和胃等组织，分别装入清洁的容器内送出。4、病理组织学检验材料的采取和寄送：根据剖检所见和疑患疾病等具体情况，有重点地选取一些组织。所用刀剪要锐利，切割组织必须迅速而准确。选取的组织应具代表性，应包括病变部和相邻部位的组织，同时也应包括器官的重要结构部分。第二节大体标本的制作和保存

一、取材所选材料应力求新鲜，要有代表性，既有病变部分，也有供对照的较为正常的部分。标本厚度以2~3cm为宜，否则固定液难于渗透。较大器官可切取一部分固定。注意要暴露的某一切面应首先切好，一般在固定后不再作切面。二、固定常用的固定液为10%。固定液的用量应为标本体积的5~10倍以上，较大标本还应在固定过程中更换固定液1~2次，固定时间约为24~28小时。三、保存固定完全的病理标本，取出在流水中充分冲洗后，即可装于盛有足量10%溶液的标本缸内，用封瓶胶封口，贴上标签。原色标本保存方法：用甲醛溶液保存的标本，因组织内的血红蛋白被破坏溶解，使原来色泽消失。如需制作原色标本时，应另选用固定液和保存液。方法：标本固定在下列固定液内，约3~10天（甲醛溶液（38%~40%100ml，硫酸钠20g，蒸馏水1000ml）；取出标本，流水冲洗2~24小时，用布吸干，移入80%~95%酒精中，至原来颜色恢复后取出；保存于下列保存液内（砒霜水溶液（2%）400ml，甘油600ml，砒霜溶解度在15℃时为1.66%，在25℃时为2%）。四、注意事项1、宜用新鲜标本：最好采取不用水洗的新鲜标本，以防红细胞溶解失色。如标本的液体过多，可用布吸干后，浸入固定液中固定。2、固定时间适中：固定时间应视标本大小及组织性质而定。时间过短，组织得不到充分固定，以后放保存液内时，可发生浑浊，甚至失去防腐作用；时间过长，使组织增加酸性．以后移入酒精中时，便不能转化为变性的血红蛋白，标本就不可能恢复原色。3、经固定的标本应冲洗干净：在流水中充分冲洗至甲醛溶液气味消失为止，用布吸干后，移入酒精中提炼，酒精可使甲醛溶液引起的酸性抗体变为碱性抗体，后者颜色明显且不易褪色。4、保持标本原色不变：加盖密封，防止阳光照射，第三节病理切片技术

从病料的采取到制成染色标本，要经过取材、固定、脱水、透明、透蜡、包埋、切片、染色和封固等步骤。一、取材1、尽早固定：病理组织应尽早固定，越新鲜越好，以免死后变化。2、取材部位：选择正常组织与病灶交界处的组织。3、取材大小：切取组织块的大小为1.6×I.5×0．5cm，如做快速切片，则厚度不能超过0.2cm4、固定前的处理：组织块固定时，不要弯曲扭转，肠壁、胃壁、胆囊壁等，可先行平放在硬纸片上，然后慢慢放入固定液中。二、固定采取的病理材料必须立即放入固定液中。这样细胞迅速死亡，能够保持细胞原有的形状和构造组织所用的固定液不能太少，一般应为组织块体积的10倍，常用的固定液是95%酒精，10%中性甲醛（）溶液，还可用混合固定液，如酒精液、辛克氏液。三、脱水：组织经固定和水洗后，组织中含有多量水分，必须先把组织内的水分除去。脱水剂必须是与水在任何比率下均能混合的液体。脱水剂兼有硬化组织的作用。最常用的脱水剂为酒精、丙酮等。1、酒精：脱水的程序为70%→80%→95%→100%。各级酒精2~4小时，100%酒精有硬化组织的作用，脱水时间不宜太长，一般不超过3小时。2、丙酮：脱水力与收缩力比酒精强，为了避免组织过度收缩要先经过低浓度丙酮（40%丙酮），再放入纯丙酮中，每级浸1小时。四、透明：透明对组织有脱酒精及透明两种作用，具有这种作用的试剂称为透明剂。常用二甲苯、松油醇等。五、透蜡：透蜡时间以能取代组织内的全部透明剂，并充分渗入石蜡为原则。先将组织块放入二甲苯加石蜡各半的混合液中，于52~58℃温箱内放置1小时，然后将标本移入保持在52~58℃。温箱中的石蜡2~3小时，或更长时间。一般的浸蜡时间为4~6小时。如用松油醇、香柏油透明，则要延长透错时间。六、包埋：将融解的石蜡倒入金属包埋框中再将透过错的组织块放入包埋框的，并将预备切的组织面向下，等到石蜡表面形成薄膜时，立即将包理器沉入冷水内15~20min，取出石蜡块按照组织块大小划分若干块加以修整。七、切片：将蜡块固定在石蜡切片机上，使蜡块的切面与刀口成平行方向，刀的倾斜度通常为15度，转动圆盘，调整切片厚度，切成4~6µm厚度的切片。持毛笔轻轻拔起切片，然后把切片放入35~40℃的温水皿中展平。切片移铺在徐有蛋白甘油的载玻片上，进入烤片箱（40~50℃，勿高于熔点），烘烤4~24时。八、染色1、染色前的推备工作：组织片经二甲苯脱蜡10~20min，然后脱二甲苯从100%、95%、80%、70%、50%酒精各2~5min左右，然后水洗5min。2、对比染色法：苏木素--伊红染色法的染色顺序：1)切片经脱蜡到水洗2)移入Harris苏木素液1~5min（淋巴组织染色时间要缩短），苏木素主要染细胞核。3)水洗4)移入1%盐酸酒精分化数秒钟至半分钟（退去跑浆颜色，保存细胞核颜色，此种区别作用称为分化）。5)中和，在加数滴饱和碳酸锂溶液的水中处理半分钟。6)流水充分洗涤。7)移入0．5%~1%伊红酒精溶液复染半分钟（主要染细胞浆）。8)脱水，95%和100%酒精各10min。9)透明，二甲苯透明10~15min。10)封固，切片上滴加中性加拿大树胶，然后覆盖上盖玻片，干后即可应用。第四章免疫学检疫方法

第一节常规血清学试验

一、凝集试验病原体颗粒性抗原与相应的抗体混合后，在适宜的电解质环境下，抗原与抗体发生特异性结合，形成肉眼可见的凝集物，这种现象称为凝集试验。参于凝集反应的抗原称为凝集原。参与凝集反应的抗体称为凝集素。抗原抗体反应时，按一定方法将抗原或抗体稀释，出现明显反应终点的抗体或抗原的最高稀释度称为效价或滴度。（一）直接凝集试验1、试管凝集试验（一种定量实验）2、玻板凝集试验（二）间接凝集试验将可溶性抗原或抗体吸附于一定分子表面，吸附抗原或抗体的载体颗粒与相应的抗体或抗原特异性结合，则可出现肉眼可见的凝集现象，称为间接凝集反应。间接凝集试验依据使用载体的不同，一般分为间接血凝试验、乳胶凝集试验、炭凝集试验等。1、间接血凝试验：将红细胞经过鞣酸或其他偶联剂处理，使多糖抗原、蛋白质抗原或抗体被红细胞表面的受体结合或吸附，这种被致敏的红细胞与相应的抗体或抗原特异性结合，可形成肉眼可见的红细胞凝集现象。2、间接乳胶凝集试验：以聚苯乙烯乳胶作为载体3、间接炭粉凝集试验：用活性炭作为致敏载体（三）血凝试验与凝集抑制试验某些病毒或病毒血凝素，可使某种或某几种动物红细胞发生凝集，病毒的这种特性称为血凝性。这种凝集现象可被特异性病毒抗血清或抗体所抑制，称为血凝抑制。二、沉淀试验（一）环状沉淀试验在小口径试管或发酵管内先加入已知抗血清，然后小心加入待检抗原于血清表面，使两种液体分界清楚。数分钟，由于抗原和抗体发生结合，两层液面交界处出现白色环状沉淀。（二）絮状沉淀试验：一定电解质环境下，抗原和相应抗体以一定比例在试管内或凹玻片内混合，经过一定时间，出现肉眼可见的絮状沉淀或颗粒状沉淀，絮状沉淀试验可用于毒素和抗毒素测定。（三）免疫扩散试验1、单向单扩散：将抗血清加于溶化的琼脂中，用毛细吸管分装于内径3mm的小试管，凝固后在其上滴加待检抗原，置密闭湿盒内，恒温下扩散。2、单向双扩散：将含有抗体的琼脂加于管底，中间加一层不含抗原同浓度的琼脂，凝固后加待检抗原。3、双向单扩散：将抗血清入琼脂中，浇成凝胶板，厚度2~3mm，在上面打孔，孔内滴加抗原，抗原在孔内向四周辐射扩散，与凝胶中的抗体结合形成白色沉淀环，换的大小与抗原浓度成正比。4、双向双扩散（常用）三、补体结合试验（一）包括两个系统：1、检测系统：又称为溶菌系统，由已知的抗原或抗体、待检的抗体或抗原以及补体组成。豚鼠血液中补体含量高，故常用新鲜的豚鼠血清代替补体。2、指示系统：又称溶血系统，由绵羊红细胞和溶血素组成，溶血素系抗绵羊红细胞的抗体。指示系统中绵羊红细胞与溶血素特异性结合形成抗原抗体复合物，不仅可以结合补体，而且在结合补体后出现溶血现象。如果发生溶血反应，说明补体结合了绵羊红细胞—溶血素形成的抗原—抗体复合物，证明检测系统中抗原与抗体不存在特异对应关系。（二）补体结合试验操作一般分预备试验和正式试验两步进行1、预备试验：包括溶血素效价测定，补体效价测定，抗原或抗体效价测定，以确定溶血素、补体、抗原或抗体的最适浓度和用量。2、正式试验：将检测系统之抗原或抗体、补体依次加入反应管中，在一定温度下感作一定时间后，加溶血素和红细胞，再感作一定时间后，判定结果。第二节免疫标记技术

利用荧光素、酶和放射性元素等作为标记物质，标记抗体或抗原分子用以示踪抗原抗体特异性结合反应，通过物理、化学等手段进行检测，使不易观察的抗原抗体反应放大并转化为可见的或可检测的反应，称为免疫标记技术。分为免疫荧光技术、免疫酶技术和放射免疫技术。一、免疫荧光技术也称荧光抗体技术，主要荧光色素有异硫氰酸荧光素（FITC）、四乙基罗丹明和四甲基异硫氰酸罗丹明，标记在抗体或抗原上，与相应的抗原或抗体特异性结合，在荧光显微镜下呈现荧光反应。通过观察标记荧光素呈现的荧光反应，检测分析特异性抗原或抗体的存在。（一）基本方法1、直接荧光抗体技术：将标记的特异荧光抗体直接滴加在抗原标本上，经一定温度和时间的染色，洗涤除去未参加反应的多余荧光抗体，在荧光显微镜下检查抗原与荧光抗体形成的特异性结合物发出的荧光。2、间接荧光抗体技术：用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，作用一定时间后，洗涤除去未反应的抗体，再用荧光素标记的抗抗体与抗原标本反应。3、补体荧光抗体技术：将未标记的抗体和补体加在抗原标本上，使其发生反应，洗涤，然后再加标记的抗补体抗体。(二）检测标本制备镜检标本的制备一般包括制片和固定两大步骤。1、制片：（1）涂片和压印片：涂片染色检查是诊断工作中最常应用的方法，适于感染动物的组织病料以及血液、脓、尿、粪便和穿刺液等。涂片方法按常规进行。压印片是将被检组织块切开，以载玻片在切面上轻压，使之粘上1~2层细胞。也可直接触压器官表面制片。自然干燥后进行固定。（2）冰冻切片和石蜡切片：冰冻切片：感染动物组织切成约3mm见方的小块，置冷台上，以6%明胶液作支持物，迅速冷冻至－15~－20℃后切片，片厚4~8µm。（3）组织培养单层细胞：盖玻片切成宽约4~5mm的飞片，装入小培养瓶内，按常规方法培养各该病毒的敏感细胞。待细胞在飞片上长成单层时，即可接种病料，经不同时间后取出被感染的细胞飞片。2、固定：用的固定液为丙酮二、免疫酶技术是将抗原抗体分子结合的特异性与酶促化学反应的敏感性有机结合而建立的一种免疫检测技术。常用的酶和底物：（1）辣根过氧化物酶：底物为过氧化氢（2）碱性磷酸酶：底物硝基苯磷酸盐（一）免疫酶技术基本方法免疫酶技术在方法上分为两类，一类用于组织细胞中的抗原或抗体成份检出和定位，称为免疫酶组织化学法或免疫酶染色法；另一种用于检测液体中可溶性抗原或抗体成分，称为免疫酶测定法。1、免疫酶染色法：本方法与免疫荧光技术相同，只是以酶代替荧光素作为标记物，并以底物产生有色产物为标志。常规免疫酶染色法可分为直接和间接两种方法。A、直接法：将被检抗原吸附于固相载体（96孔聚苯乙烯反应板），孵育后洗去未吸附的抗原，加入特异性的酶标抗体，洗涤出去未反应的物质，加入底物，底物被分解出现颜色变化，颜色变化与抗原量呈正比。B、间接法：一般检测抗体将一直抗原吸附于固相载体，孵育后洗去未吸附的抗原，随后加入被检血清，洗涤出去未反应的物质，加入酶标记的抗抗体，反应后再洗涤，再入底物，出现颜色变化，颜色变化的程度和速度与样品中的抗体量呈正比。C、双抗体夹心法：检测抗原，将特异性免疫球蛋白吸附于固相载体表面，然后加入含有抗原的溶液洗除多余的抗原，再加入酶标记的特异性抗体，反应后冲洗，加入酶底物，颜色改变与抗原量成正比。D、竞争法：测抗原将抗体吸附于固相载体表面，孵育后冲洗，加入待检抗原样品和酶标记抗原，反应后冲洗，加入酶的底物溶液，发生颜色变化。2、免疫酶测定法：免疫酶测定法分均相免疫酶测定法和固相免疫酶测定法两类。固相免疫酶测定法以ELISA应用最为广泛。3、酶结合物的制备：有戊二醛法和过碘酸钠法。三、放射免疫测定是将放射性同位素的高灵敏示踪技术与抗原抗体特异性反应有机结合用以测定介质中微量活性物质的一种检测方法。常用的放射性同位素有3H、125I、131I（一）放射免疫测定原理由标记抗原（Ag*）与未标记待检抗原（Ag）竞争性地与特异性抗体（Ab）相结合，当反应液中存在一定量的*Ag和Ab时，结合型*Ag-Ab（B）和游离型*Ag（F）的比例是一定的，保持着可逆的动态平衡。在该反应系统中加入待检的Ag，则Ag和*Ag竞相与Ab结合，Ag的量越多，B/F值或B%越小。然后分别测定B和F的比放射性，即可计算出B/F值，用已知浓度的标准Ag和一定量的*Ag、Ab反应，测出不同浓度Ag的B/F值或B%，以标准抗原浓度为横座标，B/F或B%为纵座标即可绘成竞争性抑制反应的标准曲线。同上法测出待检抗原的B/F或B%，即可在标准曲线上查出其含量。第三节变态反应

变态反应（allergy）是指已免疫的动物机体在再次接触同一种抗原物质时所发生的一种异常反应，也叫超敏反应。变态反应的发生包括致敏阶段和反应阶段两个过程。一般具有以下几个特点：①需有过敏原的刺激；②过敏原高度特异性，两次过敏原必须相同；③需经一定潜伏期，先使机体致敏，才能引起变态反应；④变态反应的表现与反应的程度既决定于抗原的质和量，也决定于机体的反应性差别。一、变应原引起变态反应的抗原称为变应原，变应原种类很多，可以是完全抗原，如微生物、寄生虫、昆虫毒液、异种动物血清和组织提取物、疫苗、动物皮毛和饲料等；也可以是半抗原，如青霉素、磺胺类药物、阿斯匹林等常用药物和有机碘、汞剂等一些化学制剂，这些半抗原只有与蛋白质结合后才表现变应原性。二、变态反应分类I型（过敏反应）、Ⅱ型（细胞毒型）、Ⅲ型（免疫复合物型）和Ⅳ型（迟发型）。前三型属体液性变态反应，其共同点是反应发生较快，有的在数分钟内达到反应高峰，常称为速发型变态反应。第Ⅳ型为细胞介导免疫应答，反应发生缓慢，一般在6~48小时才达到反应高峰，故称为迟发型变态反应。（一）I型变态反应：出现迅速、反应强烈。反应可限于一种组织，也可波及全身。所表现的症状和严重程度差异较大，但很多时候是致命性的全身反应。（二）Ⅱ型变态反应：是抗体（1gG或IgM）与相应的细胞或组织上的抗原结合，在补体、巨噬细胞和K细胞的参与下，造成细胞溶解、损伤，或被单核细胞所吞噬的反应。临诊上许多免疫性血液病均属此型。（三）Ⅲ型变态反应：当抗原进入已免疫的机体内，与抗体（1gG、IgM）在循环或体液中结合，形成中等大小的抗原-抗体复合物，若不能及时被清除，便沉积于局部毛细血管壁基底膜，激活补体、导致中性粒细胞聚集，引起血管炎症，危害机体。因免疫复合物可经循环系统遍布全身，故常引起全身反应。（四）IV型变态反应：是机体再次接触同种抗原许多小时后发生的一种以细胞免疫局部反应为主的反应。该型变态反应是以淋巴细胞和巨噬细胞为主的渗出性炎症反应。三、动物疫病的变态反应诊断最常见：结核、马鼻疽、布氏杆菌病常用方法：皮内反应、点眼、皮下反应第六章病毒学检疫技术

第一节

病毒样品的采集和预处理

一、样品的实验室处理（一）组织器官样品的处理败涂地（二）粪便样品的处理二、病毒的浓缩对病毒含量很少的病毒样品，必须经过浓缩处理。1、聚乙二醇（PEG）浓缩将分子量6000的PEG逐步加入经一般处理的样品溶液中，使终浓度为8%，置4℃过夜。3000×g离心15min，用少量含复合抗生素的PBS液重新悬浮。2、硫酸铵浓缩：将等量饱和硫酸铵溶液缓慢加入经过上述一般处理的样品溶液中，边加边搅拌，置４℃过夜，离心同上。3、超滤器浓缩：可将250~500ml的样品浓缩至20ml左右。4、超速离心浓缩：将病毒样品40000rpm离心60~120min，绝大多数病毒将沉于管底。用少量PBS溶液悬浮病毒。仅适用于小体积的样品。第二节病毒增殖、分离技术

一、动物增殖、分离病毒实验动物病毒接种法：脑内、皮内、皮下、静脉、腹腔接种法二、禽胚增殖分离病毒（1）羊膜腔接种：用于正粘病毒、副粘病毒的增殖和分离，初代分离时羊膜腔接种比尿囊腔接种敏感，用11~12日龄。（2）绒毛尿囊膜接种：用于痘病毒、疱疹病毒的增殖和分离，取10~12日龄禽胚。（3）尿囊腔接种：用于正粘病毒、副粘病毒的增殖和分离，取9~11日龄禽胚。（4）卵黄囊接种：用虫媒披膜病毒、鹦鹉热衣原体、立克次氏体的分离和增值。禽胚接种后，一般37~39℃，孵化2~7天，每天照蛋1~2次，弃去接种后24小时死亡的鸡胚，24小时后死亡的鸡胚取出后4℃冷冻4小时收获病毒。三、组织细胞增殖分离病毒细胞培养分为单层细胞培养和悬浮细胞培养。单层细胞培养包括静置培养和转瓶旋转培养，使细胞在器皿的表面生长出单层或数层细胞。单层细胞常用来分离和繁殖病毒。悬浮细胞培养，是指细胞悬浮于营养液中繁殖的一种培养方法，它可进行连续培养，便于工业化生产，常用来繁殖病毒生产疫苗。根据细胞株的不同，细胞培养又分为原代细胞培养、继代细胞培养、二倍体细胞培养和传代细胞培养等。原代细胞培养是指直接从组织消化分散的细胞进行的第一代体外培养，继代细胞培养是指将原代细胞从培养瓶壁上消化下来后再作培养，如果培养条件合适，细胞可连续传代多次传代细胞系也可通过来源于人和动物体的肿瘤组织获得。由于遗传突变或者在化学物质以及致瘤病毒的作用之下，继代培养细胞中有时出现恶性变异细胞，此类细胞具有很高的生长和繁殖势能，几乎可以无地传代，称为传代细胞，传代细胞系也可通过来源于人和动物体的肿瘤组织获得。（一）动物细胞培养方法1、原代细胞的培养（1）选择9~10日龄鸡胚（或12~14日龄鸭胚），用70%~75%酒精消毒胚蛋外壳。（2）从气室端打开卵壳。取出鸡胚，取头、脚和内脏，将躯干置于一灭菌小烧杯内，用预冷的PBS溶液冲洗，用灭菌剪刀剪碎,加入PBS液冲洗组织碎块，出去血液。（3）加入4~6倍体积的胰蛋白酶溶液，37℃消化10~30分钟，每隔10分钟摇动一次。（4）去掉上清液，加入PBS洗涤2次。（5）去掉上清液，加细胞生长液制成10%的悬液，于4℃可保存3~4天；做细胞培养用，则再作1∶40的稀释（终浓度1∶400），然后分装到培养瓶中，于37℃培养48小时。2、继代细胞的培养（1）侵出培养瓶中原有的细胞生长液，加入无钙、镁的PBS冲洗一次细胞表面。（2）加入胰蛋白酶溶液，室温下不时摇动细胞瓶，直至细胞瓶发白、卷边，即将脱落。（3）侵出消化液，轻拍轻拍细胞瓶，摇散细胞，再加入细胞液，并进一步摇散细胞。（4）根据细胞生长情况，分装2~4个细胞瓶，培养于适宜温度，应于36小时长成单层。3、病毒接种（1）选择新长满的细胞单，弃掉旧的细胞生长液，每个细胞瓶，以浸没细胞单层为宜。置37℃吸附60min。若样品溶液很少以致不能浸没细胞单层时，可将细胞瓶置于摇床上，缓慢摇动，使样品不断浸润全部细胞单层。（2）补加5倍或10倍于样品溶液的细胞维持液于37℃培养。（3）每天观察细胞病变（CPE），当发生CPE时，做进一步鉴定。第三节病毒鉴定

一、理化特性鉴定氯仿敏感性试验、酸敏感性试验、热敏感性试验、阳离子稳定性试验二、电子显微镜观察（一）样品制备1、粪便：用蒸馏水将粪便制成10%悬液，加入灭菌玻璃珠打匀，对半加入氟利昂混匀，以1000×g离心10min，取水相进行浓缩病毒。用几滴蒸馏水重悬沉淀作为观察样品。2、病毒细胞培养物：当细胞出现CPE时，冻融1-3次，以1000×g离心10min去渣，上清液按上文方法进行病毒浓缩，用几滴蒸馏水重悬沉淀作为观察样品。3、脓汁或C外样品：将样品在载玻片制成抹片自然干燥，以少量蒸馏水重新悬浮样品材料。（二）负染技术1、等量病毒悬液与2%的磷钨酸染液混合。2、滴加到有支持膜的金属载网上。3、吸去过多的病毒然也混合物，电镜下观察。（三）免疫复合物的电镜观察1、选择高滴度的病毒作为抗原，2、用等量经适当稀释的抗血清对少量病毒进行处理，置于一密封容器中，37℃感作1小时3、加一滴每种方法处理的病毒样品于载网上，用2%的磷钨酸钾染色，电镜观察。4、通过观察免疫血清与病毒粒子的特异性凝集而形成的大颗粒复合物以鉴定病毒。第七章寄生虫学检疫技术

第一节

粪便寄生虫检查

一、粪便检查基本方法（一）肉眼观察：是检查寄生虫的基本方法。寄生于动物消化道的绦虫会不断随宿主粪便排出呈断续面条状（白色）的孕卵节片；其他一些消化道寄生虫有时也可随粪便排出体外。（二）涂片检查：取50％甘油水溶液或普通水1～2滴放于载玻片上，直接取黄豆大小的被检粪便（块）与之混匀，剔除粗粪渣，加盖玻片，镜检虫卵。但检出率不高。（三）虫卵漂浮法：主要用于检查线虫卵、绦虫卵及球虫卵囊等。取大约10g粪便弄碎，放于一容器内，加入适量饱和盐水搅匀过滤，静置0.5h左右，用直径0.5～1.0cm的金属圈蘸取表面液膜，抖落于载玻片上，加盖玻片后镜检；常用的漂浮液还有亚硫酸钠饱和液、硫酸镁饱和液、钠饱和液、铵饱和液、铅饱和液等。检查相对密度较大的虫卵，如棘头虫虫卵、猪肺丝虫虫卵及吸虫卵时，需用硫酸镁、硫代硫酸钠以及硫酸锌等饱和溶液。（四）虫卵沉淀法：取一定量的粪便（大约5～l0g）捣碎，放于一容器内，加5～10倍量清水搅匀，经40～60孔铜筛滤去大块物质后，让其自然沉淀约20min，将上清液倒掉，再加入清水搅匀，再沉淀。如此反复进行2～3次，至上清液清亮为止。最后倾倒掉大部分上清液，留约为沉淀物2倍的溶液量，用胶帽吸管吹吸均匀后，吸取少量于载玻片上，加盖玻片镜检。使用离心沉淀法取代自然沉淀法，可以大大缩短沉淀的时间。（五）虫卵计数法：常用的方法有麦克马斯特氏法，计数时，取2g粪便弄碎，放入装有玻璃珠的小瓶内，加入饱和盐水58ml充分震荡混合，通过粪筛过滤。然后将滤液边摇晃边用吸管吸取少量，加入计数室内，放于显微镜载物台上，静置几分钟后，用低倍镜将两个计数室内见到的虫卵全部数完，取平均值乘以200，即为每克粪便中的虫卵数。（六）幼虫培养法：常用的方法是在培养皿底部加滤纸一张，而后将欲培养的粪便加水调成硬糊状，塑成半球形，放于皿内的纸上，并使半球形粪球的顶部略高出平皿边沿，使加盖时与皿盖相接触。将此皿置25～30ºC温箱（夏季放置室内即可）中培养，注意保持皿内湿度（应使底部的垫纸保持潮湿状态）。7～l5d后，多数虫卵即可发育成第三期幼虫，并集中于皿盖上的水滴中。将含有幼虫的水滴吸出置载玻片上，用显微镜检查。（七）幼虫分离法：又称贝尔曼氏法，用一小段乳胶管两端分别连接漏斗和小试管，然后置漏斗架上，通过漏斗加40℃温水至漏斗中部，漏斗内放置上有被检材料（粪便或组织）的粪筛或纱布。静置1～3h后，大部分幼虫游走沉于试管底部。此时拿下小试管，吸弃上清液，取管底沉淀物镜检。也可将分离装置放入温箱内过夜后检查。也可用简单平皿法分离幼虫。取粪球若干个置于放有少量温水（不超过40℃）的表面玻璃或平皿内，经10～l5min后，取出粪球，吸取皿内液体，在显微镜下检查幼虫。（八）毛蚴孵化法：取被检粪便30～100g（牛100g）经沉淀集卵法处理后，将沉淀倒入500ml三角烧瓶内。加温清水（自来水需脱氯处理）至瓶口，置22～26℃孵化。第1、3、5小时，用肉眼或放大镜观察并记录一次。如见水面下有白色点状物做直线来往运动，即是毛蚴，必要时吸出被检液用显微镜观察。第二节组织寄生虫检查

一、血液寄生虫检查（一）涂片镜检：一般在病畜体温升高时采集耳静脉血。用载玻片接触最先流出的一滴血；或用注射器吸取血液滴于载玻片，制成血液涂片。干燥后用姬姆萨或瑞氏染色法染色镜检。（二）鲜血压滴观察：先将一滴生理盐水置于载片上，然后滴上一滴被检血液，充分混合，加盖盖玻片，静置片刻。显微镜下用低倍镜检查，发现有运动可疑虫体时，可再换高倍镜检查。该法主要是检查血液中虫体的运动性。（三）虫体浓集法：当血液中虫体较少时，常先进行集虫，再制片检查。采病畜血6～7m1（加抗凝剂），500r/min，离心5min，使其中大部分红细胞沉降。然后将含有少量红细胞、白细胞和虫体的上层血浆移入另一离心管，补加适量生理盐水，2500r/min，离心10min，取沉淀物制成抹片，染色检查。此法适用于伊氏锥虫病和梨形虫病。锥虫和感染有梨形虫的红细胞较正常红细胞的比重为轻，所以在第一次沉淀时，正常红细胞下降而锥虫和感染有梨形虫的红细胞尚悬浮在血浆中。第二次离心沉淀时，则将其浓集于管底。二、鼻腔和气管分泌物寄生虫检查检查时，用棉拭取鼻腔和气管分泌排泄物，将采得的黏液涂于载片上镜检。为了得到较多的检查物，可用手小心轻压气管或喉头上部以引起动物咳嗽。三、其他组织寄生虫检查法有些原虫可以在动物身体的不同组织内寄生。一般在死后剖检时，取一小块组织，以其切面在载玻片上做成抹片、触片，或将小块组织固定后制成组织切片，染色检查。抹片或触片可用瑞特氏染色液或姬姆萨氏染液染色后观察。感染泰勒虫的病畜，常呈现局部体表淋巴结肿大。可取淋巴结穿刺物，进行显微镜检查。肌肉中旋毛虫的检查，传统方法为镜检法，但目前欧美等国多用消化法。家畜患弓形虫病时，除死后可在一些组织中找到包囊和速殖子外，生前诊断可取腹水，检查其中的滋养体。镜检法：取膈肌肉样0.5～1.0g，剪成3mm×l0mm的小块，用厚玻片压紧，放显微镜下检查或投放到屏幕上观察。第三节体表寄生虫检查

—、螨的检查（一）疥痒螨的刮取与观察在宿主皮肤患部与健康部交界处，用外科凸刃小刀，在酒精灯上消毒，使刀刃与皮肤表面垂直，反复刮取表皮，直到稍微出血为止（此点对检查寄生于皮内的疥螨尤为重要）。将皮屑放于载玻片上，滴加50％甘油溶液，覆以另一张载玻片。搓压玻片使病料散开，置显微镜下检查。采用浓集法提高检出率。先取较多的病料，置于试管中，加入10％氢氧化钠溶液，浸泡过夜（如急待检查可在酒精灯上煮数分钟），使皮屑溶解，虫体自皮屑中分离出来。待其自然沉淀（或以2000r/min的速度离心沉淀5min），虫体即沉于管底，弃去上层液，吸取沉渣检查。最好的方法是将刮下物放在黑纸上，置温箱中（30～40℃）或用白炽灯照射一段时间，然后收集从皮屑中爬出的黄白色针尖大小的点状物在镜下检查。该方法可收集到与皮屑分离的干净虫体。（二）蠕形螨的检查寄生在毛囊内，检查时先在动物四肢的外侧和腹部两侧、背部、眼眶四周、颊部和鼻部的皮肤上触摸有无砂粒样或黄豆大的结节。如有，用小刀切开挤压，看到有脓性分泌物或淡黄色干酪样团块时，则可将其挑在载片上，滴加生理盐水1～2滴，均匀涂成薄片，上覆盖玻片，于显微镜下进行观察。二、虱和其他吸血节肢动物寄生虫检查手持镊子进行仔细检查，采到虫体后放入有塞的瓶中或浸泡于70％酒精中。注意从体表分离蜱时，切勿用力过猛。应将其假头与皮肤垂直，轻轻往外拉，以免口器折断在皮肤内，引起炎症。虫体鉴定，月新鲜越好，当时难以鉴定的虫体要及时清洗，用70％的酒精（或高度白酒）或巴氏液（3％生理盐水）固定，注意吸虫和绦虫为了将来做鉴定，需在固定之前，进行压薄加工。即把吸虫和选择出的绦虫节片（头节、成熟节片、孕卵节片）放于两张载片之间，适当加以压力，两端用线或橡皮绳扎住，投入固定液中固定。吸虫、绦虫节片和某些原虫需经染色后制片；线虫、节肢动物和个别原虫一般不必染色就可制片。第五节寄生虫动物接种

一、伊氏锥虫试验动物：用小鼠、大鼠、豚鼠、兔或犬。接种量：0.5～1.0ml接种材料：用可疑病畜的抗凝血液接种位置：腹腔或皮下。二、马媾疫锥虫将病畜的阴道或尿道刮取物与无菌生理盐水混合，接种于公家兔的睾丸实质中三、胎儿毛滴虫取病牛阴道分泌物或包皮冲洗液为病料，接种于妊娠豚鼠的腹腔内，在接种后1～20d，可以使妊娠豚鼠发生流产，在其流产胎儿的消化道和胎盘里可查出大量的毛滴虫。四、弓形虫是多宿主原虫，小鼠对之特别敏感，常常仅数十个虫体即可使小鼠感染发病。一般取急性死亡的可疑动物的肺、淋巴结、脾、肝或脑组织，以1∶5的比例加入生理盐水，制成乳剂，并加少量青霉素和链霉素以控制杂菌感染。吸取乳剂0.2ml接种于小鼠腹腔，一般急性者在4～5d后发病，病鼠腹部膨大，有大量腹水，抽取病鼠或病死鼠的腹水作涂片，染色检查，可见大量游离的速殖子。第八章生物技术在动物检疫中的应用

第一节核酸分子杂交技术

一、核酸分子杂交技术原理核酸分子杂交是指具有互补性的DNA单链相互配对形成DNA-DNA双链，或者DNA单链和互补的RNA链相互配对形成DNA－RNA杂合双链的过程。核酸分子杂交技术是指在一定条件下，用标记的核酸（DNA或RNA）分子和与之同源的核酸分子之间通过碱基配对原则形成双链杂交分子，通过检测杂交分子部分双链上标记物的存在对特定核酸序列进行定位或鉴定的方法。被标记的核酸通常称为核酸探针。探针是指只有同特异性目标产生相互作用且可对其相互作用的产物进行有效检测的生物分子。（一）核酸分子杂交的动力学基础：碱基互补配对（二）核酸的可标记性核苷酸分子经标记物标记或修饰后，仍可以实现碱基配对核酸分子碱基上存在一些标记、修饰位点。如胞嘧啶和尿嘧啶的C5位，胸腺嘧啶的C6位及鸟嘌呤、腺嘌呤的C8位都与碱基间氢键的形成无关，是有用的标记修饰位点；胞嘧啶的N4位和腺嘌呤的N6位虽然参与氢键的形成，但亦可作为标记、修饰位点。要得到有效的核酸探针，每1000个碱基中须有10~30个掺入修饰物的碱基。用放射性同位素32P和35S等标记核酸时，由于同位素掺入核酸的磷酸二脂键骨架中，因此不存在碱基的修饰。（三）标记核酸物质的可检测性放射性标记探针通常用放射自显影技术检测，非放射性标记探针。如生物素标记探针，用与链霉亲和素偶联的碱性磷酸酶系统检测；地高辛标记探针，用抗地高辛抗体偶联的碱性磷酸酶系统检测。二、探针核酸的获得1、直接用病毒基因组核酸作为探针核酸，标记后制成核酸探针，2、通过提取纯度较高的相应的mRNA或正链RNA病毒的基因组RNA，在逆转录酶作用下，反转录成cDNA，标记后制成cDNA探针。3、分离纯化染色体DNA或病毒核酸，然后用超声波或其他方法随机打断，或者用性内切酶进行部分降解，得到许多随机片段，选择长度在15~20Kb左右的片段，重组到λ噬菌体中，经过体外包装后转染大肠杆菌，再通过菌落原位杂交技术筛选出含目的基因的片段，标记后制备的探针称为克隆探针。4、依据蛋白质的氨基酸顺序，反推出基因编码区的可能的DNA核苷酸序列，化学合成出特定特定的核苷酸，标记后用做探针核酸。三、探针核酸的标记方法（一）缺口转移法用DnaseI在双链DNA上随机地产生单链缺口，暴露出一个游离的3′-OH末端基团；大肠杆菌DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性在缺口的5′一侧移去一个5′-核苷酸；同时DNA聚合酶I5′→3′聚合酶活性在3′一侧补上一个新的核苷酸。由于聚合酶I不能够在3′-OH和5′-P之间形成一个键，反应将继续进行，5′一侧的核苷酸不断地被移去，3′一侧的核苷酸又按序增补，于是缺口便沿着DNA分子按合成的方向移动,在缺口转移过程中，如果底物核苷酸为放射性元素如32P所标记，则在新合成的DNA链中就有均匀的放射性同位素标记。（二）随机引物延伸法利用随机的寡核苷酸引物与变性的双链DNA模板随机退火，用Klenow大片段酶进行延伸。的5′→3′聚合酶活性将底物dNTPs（脱氧核苷酸）聚合到随机引物游离3′-OH末端，最终形成模板DNA的互补链。如果底物脱氧核苷酸的一种或几种被放射性同位素所标记，就形成标记探针。（三）末端脱氧核苷酸转移酶加尾法末端转移酶可催化5′脱氧核苷三磷酸进行5′→3′方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线形DNA分子的3′-OH末端，末端转移酶不需要模板存在就可以催化DNA分子发生聚合作用。当反应混合物中只有一种dNTP时，就可以形成仅有一种核苷酸组成的3′尾巴。四、核酸分子杂交分为固相杂交法和液相杂交法,固相杂交是先将待检测核酸结合到一定的固相支持物上，再与溶液中的标记探针完成杂交，常用纤维滤膜及尼龙（nylon）滤膜。基本步骤：1、通过印迹技术（blotting）将样品核酸或者含有目的基因片断的菌落、噬菌斑等转移到固相支持物上；2、用标记探针与支持物上的核酸片段进行杂交；3、杂交信号的检测。（一）核酸印迹技术主要包括Southern印迹、Northern印迹、western印迹，斑点印迹和菌落印迹等技术。1、Southern印迹：依据毛细管作用的原理，将琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段转移并结合到适宜的固相支持物上，然后利用标记的单链DNA或RNA探针进行杂交并检测的过程。2、Northern印迹：与Southern印迹过程基本相同，但RNA的变性方法与DNA不同。DNA样品可先通过凝胶电泳进行分离，再用碱处理凝胶使DNA变性，而RNA不能用碱变性，因为碱会导致RNA水解。因此，在Northern印迹前，须进行RNA变性电泳，在电泳过程中使RNA解离形成单链分布在凝胶上，再进行印迹转移。3、western印迹：将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到纤维素膜上，用标记的探针进行反应，检测特定蛋白质的方法。4、斑点印迹和狭线印迹：用多孔过滤加样器将核酸样品直接点样在适当的杂交膜上，然后进行杂交并检测的方法。斑点印迹为圆形，狭线印迹为线性，斑点印迹更清晰，定量更准确。5、菌落印迹：将菌落转移到纤维素滤膜上，在原位发生溶菌、DNA变性，将带有DNA印迹的滤膜烤干后，再与标记的特异性探针杂交，漂洗除去未杂交的探针，对照原来的平板，从中挑选出含有插入序列（重组DNA分子）的菌落。

五、杂交反应的基本过程包括预杂交、杂交和漂洗等，预杂交的目的是用非特异性DNA分子（小牛胸腺DNA）及其他高分子化合物，将待测核酸分子中的非特异性位点封闭，以避免这些位点与探针的非特异性结合。杂交反应是使单链核酸探针与固定在膜上的待测核酸单链在适当温度和一定条件下进行复性反应的过程。杂交反应完成后，进行洗膜处理以洗去非特异性杂交以及未杂交的标记探针，膜洗净后，便可进行杂交信号的检测。第二节聚合酶链式反应(PCR）

一、基本原理PCR将靶DNA作为模板，与模板片段两端互补的两种寡核苷酸为引物，经过模板DNA变性、模板与引物退火结合以及在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸，合成与模板链互补的新DNA链。PCR是依据体内DNA的复制过程设计的。一个PCR循环可分为三步反应。第一步为高温变性，即高温（94~95℃）使模板DNA双链间氢键断裂而解离形成两条单链；第二步低温退火，经高温变性之后突然降温（55~56℃），使特异性引物按碱基配对规则与变性的单链DNA模板上的相应互补区配对结合(也存在两条模板链之间的结合，但由于引物有高浓度、结构简单等特点，所以退火主要发生在模板与引物之间）；第三步中温（72℃）延伸，在4种dNTP底物和Mg+存在的条件下，从引物的3′端开始，由DNA聚合酶催化合成与模板链互补的新DNA链。每一循环的DNA产物经变性又成为下一个循环的模板。经n次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，理论值应是2n。二、DNA聚合酶现在常用与PCR反应的是TaqDNA聚合酶具有5′→3′核酸外切酶活性，而缺乏3′→5′核酸外切酶活性，具有5′→3′聚合酶活性，按5′→3′方向合成新生互补链，这种DNA聚合酶具有耐高温的特性，而且在比较宽的温度范围内都保持这催化DNA合成的能力，TaqDNA聚合酶的最适温度为75～80℃，一般选择72℃作为延伸温度。三、引物PCR扩增引物，是指人工合成的与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的寡核苷酸片段，包括引物1和引物2两种。引物1是5′端与反义链互补的寡核苷酸，引物2是3′端与正义链互补的寡核苷酸。两引物在模板DNA上的结合位点之间的距离决定了扩增区段的长度，理想扩增跨度1kb，有效扩增跨度2kb，引物可以决定PCR扩增的特异性与长度，引物设计一般应遵循如下原则：①引物长度一般以15～35bp为好。引物太短时会影响PCR的特异性，而引物过长时，则会增加成本。②引物中的G+C含量，一般以40％～60％为宜。③4种碱基应随机分布，嘌呤或嘧啶不要有3个以上的连续排列。尤其在以物的3′端，不能存在3个G或C连续排列，否则会形成引物与核酸G（或C）富集区之间的错误互补，进而影响PCR特异性。④引物自身不含互补序列，否则会形成发卡式的二级结构。⑤两个引物之间，不会形成引物二聚体。⑥引物的5′端可以修饰，用生物素、荧光物质、地高辛等标记，以及引入突变位点。五、底物：dNTP为PCR合成的底物，各种dNTP浓度应相同，一般浓度范围为20～200µmol/L。六、PCR的应用（一）传染病的早期诊断和不完整病原体检疫PCR技术可对未形成病毒颗粒的DNA、RNA或样品中病原体破坏后残留的核酸分子迅速进行扩增测定，且仅需提取微量DNA分子即可以得出结果。（二）快速、准确、安全检测病原体PCR技术适用于检测慢性感染、隐性感染，尤其适用于难培养的病毒的检测。（三）制备探针和标记探针用PCR直接扩增某特异的核酸片段，经分离提取后用同位素或非同位素标记制得探针。也可在反应液中加入标记的dNTP，经PCR将标记物掺入到新合成的DNA链中。（四）在病原体分类和鉴别中的应用用PCR技术可准确鉴别某些比较近似的病原体，如蓝舌病病毒与流行性出血热病毒，牛巴贝斯虫和二联巴贝斯虫等。第三节性内切酶图谱分析

指同一种DNA用不同的性内切酶进行切割，比较分析各种不同的电泳谱带，推出该DNA分子上性内切酶的切割位点数和分布情况。绘制出的标明性内切酶在该DNA分子上的分布图叫做该DNA分子的性内切酶图谱。对确定进出境动物及动物产品所携带病毒是疫苗株还是野毒株，有很重要的意义。一、性核酸内切酶性核酸内切酶是一类识别双链DNA中某种特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。主要分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三种类型。Ⅰ型性内切酶在DNA链上没有固定的切割位点，一般在离识别位点1kb到几kb的地方随机切割，不产生特异性片段。Ⅲ型性内切酶从距识别位点一侧约25bp处单链切割DNA分子。通常所说的性酶是指Ⅱ型酶，它能够识别与切割DNA链上的特定的核苷酸顺序，产生特异性的DNA片段。绝大多数的Ⅱ型核酸内切酶，都能够识别由4－8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列，从其识别序列内切割DNA分子的。其识别序列，大部分具有回文序列。Ⅱ型核酸内切酶切割DNA链时，总是水解核苷酸3'，5'磷酸二酯键的3'位磷酸酯键，使产物的5'端带磷酸单酯基团，而3'末端则为游离羟基。因此某一种酶的全部产物的末端具有相同的结构。产物的末端可分为粘性末端和平末端。