miseq实验流程

2.1.1 基因组DNA抽提

默认用E.Z.N.A.® Soil DNA Kit（D5625-01）进行样品提取。完成基因组DNA抽提后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA，用NanoDrop2000进行浓度的检测。（具体参考多样性样品质检报告）

一、 项目基本信息

项目名称 项目联系人 收样员 质检员 报告撰写人 报告终审员

多样性 项目跟进销售 合同编号 收样日期 质检日期 报告审核员 报告日期 二、 样品检测方法

 D DN

A 样品检测结果 N三、纯A度完检整测性方、 N0. 美吉编号 样品名称 浓度（ng/μl） OD 260/280 OD 260/230 NanoDrop2000 总量检

胶图(取2μl样品跑胶)：

2.1.2 PCR扩增

按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物。

为保证后续数据分析的准确性及可靠性，需满足两个条件，1) 尽可能使用低循环数扩增；2) 保证每个样本扩增的循环数一致。随机选取具有代表性的样本进行预实验，确保在最低循环数中使绝大多数样本能够扩增出浓度合适的产物。

PCR 采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase； PCR仪：ABI GeneAmp® 9700型；

全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱； 2%琼脂糖电泳检测。（具体参照PCR实验报告）

PCR扩增报告

1. 项目基本信息

项目名称 项目联系人 收样员 PCR操作员 报告撰写人 项目跟进销售 合同编号 收样日期 PCR报告日期 报告审核员 2. PCR预实验

2.1引物设计

测序区域 引物名称 引物序列 2.2 PCR扩增条件

为了保证后续数据分析的准确性及可靠性，需要两个条件，首先是尽可能使用低循环数扩增；其次保证每个样品扩增的循环数统一。为了达到以上目的，我方首先随机选取10个样品进行预实验，以确保在最低的循环数中绝大多数的样品能够扩增出浓度合适的产物，为所有样品的正式试验做充分准备。

在预实验完成后，PCR 正式试验采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20μl反应体系：

5×FastPfu Buffer .....................4 μl 2.5 mM dNTPs.........................2 μl Forward Primer(5 μM).......... 0.8μl Reverse Primer(5 μM) ......... 0.8μl FastPfu Polymerase..............0.4 μl Template DNA ......................10ng

_____________________________________________________

补ddH2O至.........................20 μl

PCR仪：ABI GeneAmp® 9700型 PCR反应参数：

a. 1× (3 minutes at 95°C)

b. 27× (30 seconds at 95°C；30 seconds at 55 °C；45 seconds at 72°C) c. 10 minutes at 72°C，10°C until halted by user

2.3 PCR扩增结果鉴定胶图

2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，3μl上样检测电泳图：

2.4 PCR扩增结果

我方已将贵方样品进行PCR扩增条件摸索，截止目前的PCR扩增结果统计如下：

胶图编号

样品名称 实验名称 测序引物 Tm（℃） cycles 结果 2.5 结果说明

结果代码 A B C

预实验结果说明 PCR产物目的条带大小正确，浓度合适，可进行后续实验； PCR产物目的条带大小正确，浓度偏低，可尝试进行后续实验； PCR产物目的条带太弱或未检测到，无法进行后续实验，需要重新提供样品；

2.1.3 荧光定量

参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluor™ -ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。

2.1.4 Miseq文库构建

1) 连接“Y”字形接头；

2) 使用磁珠筛选去除接头自连片段； 3) 利用PCR扩增进行文库模板的富集； 4) 氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。

2.1.5 Miseq测序

1) DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；

2) 另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥 (bridge)”； 3) PCR扩增，产生DNA簇； 4) DNA扩增子线性化成为单链。

5) 加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基； 6) 用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类； 7) 将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸； 8) 统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。