诱导多功能干细胞研究涉及的技术

综述

诱导多功能干细胞研究涉及的技术

作者 李建雄 09级七年制二系 093335

摘要

诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是体细胞在外源因子作用下，经直接细胞核程序重整而重新获得多潜能的干细胞．iPSCs在疾病的模型建立与机理研究、细胞治疗、药物的发现与评价等方面有着巨大的潜在应用价值．在过去几年中，科学家们致力于改进体细胞重编程技术并取得许多突破．本文就iPS细胞研究关键环节—一诱导系统涉及的技术进行综述与展望。

关键词

体细胞重编程，诱导多潜能干细胞, 整合型载体,非整合型载体，新型载体，蛋白质转染, 细胞膜的通透性观察，DNA甲基化, RNA干扰实验，信号通路

引言

干细胞是人体及各种组织细胞的最初来源，具有高度自我复制能力、高度增殖及多向分化潜能，从发现之日起一直倍受学者关注。20世纪末以来，胚胎干细胞成为各国研究的重点。然而，胚胎干细胞的获取主要还是来自早期发育的囊胚，而这一阶段涉及许多对生命的界定问题，各国因信仰、民俗及文化背景的不同引起胚胎干细胞研究激烈而敏感的伦理之争；同时，胚胎干细胞的获取和保存也受现实条件的。因此，怎样采用非胚胎材

料直接产生多能性干细胞成为生命科学研究发展的重要瓶颈。作为细胞重编程研究的里程碑，2006年， Yamanaka小组“将Oct4、Sox2、c．Myc和KH4等4个转录因子导入小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonic fibroblasts，MEFs)中，成功获得与小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在表型、生长特性、基因表达和分化潜能等方面高度相似的小鼠诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell， iPS cell) 【1】，从此，iPS细胞的研究日趋火热。美国Thomson小组报道了通过转染Oct-4、Sox2、Nanog及Lin284个基因可将人的成纤维母细胞重编程为iPS细胞【2】。iPS细胞在其形态学、增殖特性、干细胞标志物的表达、表观遗传修饰上都与ESCs无显著差别【3-4】，研究表明：鼠iPS细胞能有效分化为造血和神经祖细胞，并能在体内和体外分化为血液及神经系统的各种细胞【5-6】。亦有研究证明，人体iPS细胞和小鼠iPS细胞均可分化为心肌细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞【7-9】；同时，iPS细胞孕育而成的活体小鼠，有力地证明了iPS细胞具有真正的“全能性” 【10】。但到目前为止，iPS细胞的研究才刚刚起步，一些重要的科学问题与关键技术问题还没有完全解决，iPS细胞走向临床应用为时尚早。本文就近几年iPS 细胞研究所涉及的技术作一回顾，从具体操作上把握iPS研究和应用方向，加深对ips的认识，以期对有志于此的医学生未来的学习研究工作有所帮助．

1、基因导入技术

把已知基因转移到真核细胞,并且整合到基因组中得到稳定表达的技术,称为基因导入。基因导入技术是制备ips细胞的主要技术，而基因载体又是推动无遗传修饰ips细胞的建立的关键。载体主要有整合型载体、非整合型载体以及新型载体。

1.1.整合型载体介导的基因导入技术

早期使用的病毒载体，如逆转录病毒载体、慢病毒载体、诱导表达的慢病毒载体、单

一慢病毒载体及piggyBac转座子都属于整合型载体【11】。反转录病毒载体的结构包括已切除了病毒的结构基因gag，大部分pol和env，以及两侧的LTR，被选择(标记)基因和目的基因插入的多聚位点所取代，同时还带有包装信号ψ。逆转录病毒载备首先要有适当的包装细胞系，以利于产生高滴度的病毒，另外还具有适当的结构。如：ψ2(第一代包装细胞)，PA317(第二代包装细胞)，ψ1-CRIP、PG13、DA、CFA(第三代包装细胞)，包装细胞可提供逆转录病毒gag、pol和env蛋白才能使带有包装信号及目的基因的病毒载体RNA进行包装，包装细胞只提供gag、pol和env蛋白而不产生具有复制能力的野生型病毒(RCR)，而第一代包装细胞可产生 RCR，安全性较差；第二代包装细胞，临床上已广泛应用，也未发现产生RCR，安全性好；第三代包装细胞更加安全，第三代包装细胞中主要区别是病毒结构基因中env不同。

1.2.非整合型载体介导的基因导入技术

腺病毒载体、RNA病毒、附着体和质粒都属于非整合型载体。腺病毒载体[27]、RNA 病毒[28-29]、附着体[30]和质粒[25,31]等非整合型载体已成功制备iPS 细胞，但重编程效率往往较整合型载体低．而且也存在载体基因污染、转基因表达难以精确和引起癌变风险

1.3.新型载体介导的基因导入技术

新型载体中非病毒微环状载体能高效率制备无遗传修饰ips细胞，最近研究发现，仅病毒载体也能重编程体细胞为ips细胞。Jia 等[25]建立非病毒微环状载体携带Oct4、Sox2、Lin28 和Naong(reprogramming cassette，使用2A 肽段和IRES，高效表达4 个转录因子)诱导脂肪干细胞重编程为iPS 细胞，该载体能高效率制备无遗传修饰iPS 细胞．最近研究[26]发现，仅病毒载体也能重编程体细胞为iPS 细胞，这一发现为利用基因

导入技术获取iPS 细胞提供新思路．此外，能高效诱导iPS 细胞的重组腺病毒载体，该载体能高效并介导体细胞重编程为iPS 细胞【13-24】。

2、蛋白质转染技术

2.1蛋白质转染诱导ips细胞

为克服当前基因操作风险，丁胜研究组首次采用蛋白质转染技术制备iPS 细胞[32]，添加化学小分子丙戊酸(valproic acid，VPA)情况下，融合穿膜肽11R (poly-arginine) 的蛋白质组合11R-Oct4、11R-Sox2、11R-Klf4、11R-c-Myc 和11R-Oct4、11R-Sox2、11R-Klf4 2 种组合分别将小鼠成纤维细胞重编程为iPS 细胞．随后，Kim 研究组[33]使用融合穿膜肽9R(poly-arginine)的蛋白质组合9R-Oct4、9R-Sox2、9R-Klf4、9R-c-Myc 重编程人新生儿成纤维细胞为iPS 细胞．蛋白质转染技术制备的iPS细胞无任何遗传修饰，避免了基因操作和毒副化学物质带给iPS 细胞的潜在风险，提高了临床应用安全性．蛋白质高效转染技术存在三个核心问题：a．如何实现蛋白质从培养基进入细胞浆；b．怎样避免蛋白质被溶酶体持续俘获；c．如何保证蛋白质从胞浆正确入核．钱其军等通过建立高效双穿膜肽系统【11】，重编程蛋白被核转运蛋白复合体识别而高效入核的同时，导入能破坏蛋白质穿膜时形成巨胞饮泡的小肽，使蛋白质被释放，避免被溶酶体捕获降解．除利用穿膜肽做蛋白质载体外，也可通过增加细胞膜通透性或纳米隧道途径使蛋白质进入细胞，如链球溶菌素O(streptolysin-O, SLO)可增加细胞通透性使ES 细胞提取物进入293T 细胞[35].此外，是否仅用酶来催化相关蛋白实现重编程也有待研究．细胞膜的通透性研究也为蛋白质从胞浆入核提供了依据。

3、化学药物诱导技术

体细胞重编程效率低(＜0.01%[1, 36])且动力学缓慢(2～3 周)，极大制约iPS 细胞研究与应用。 化学物质可以提高重编程效率，并且能功能性替代某些转录因子，其主要通过影响细胞表观遗传修饰和信号转导通路发挥作用。

3.1 表观遗传途径

表观遗传修饰在体细胞重编程程中有着重要作用，化学小分子可通过改变体细胞的DNA甲基[38-39]、组蛋白修饰(乙酰化、甲基化和磷酸化等)[37]等表观遗传特性提高重编程效率。

3.1.1DNA甲基化

DNA甲基化的分析方法很多，可分为总基因组甲基化的检测和单基因序列特异性甲基化分析的研究。总基因组甲基化的检测又分为全基因组序列特异性甲基化分析和基因组非特异性甲基化水平的研究。前者包括甲基化差异性杂交显示(differential methylation hybridization，DMH)、寡核苷酸微阵列法和基因组性酶切扫描法(restriction landmarkgenomescanning，RLGS)；后者包括3H—SAM掺人后液闪检测法和高压液相色谱法。对单基因序列特异性甲基化分析包括传统的甲基化敏感的性内切酶(methylation sensitive restriction endonucleases，MSREs)分析、比较简洁的甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)、全面反映甲基化情况的亚硫酸氢钠变性后测序(bisulfitegenomic sequencing)、甲基化敏感性单核苷酸引物扩增(methylation sensitive single nucleotide primer extension，Ms—SnuPE)、较新颖的甲基化荧光检测(methylight)、结合亚硫酸氢钠变性的性酶分析(combined bisulfite restrictionan alysis，COBRA)、酶的区域性甲基化特异性分析(enzymatic regional methylation assay，ERMA)和变性高压液相色谱法(denaturing high performance liquid

chromatography，DHPLC)。

3.1.1.1甲基化敏感的单核苷酸的扩增(Ms—SnuPE)

Ms—SnuPE即甲基化特异的单核苷酸扩增，它能对不同甲基化特异位点进行快速定量，是一种快速估计特异性CpG位点甲基化不同情况的定量方法。先用重亚硫酸盐处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。进行PCR扩增，然后取等量扩增产物置于2管中，分别作为Ms—SnuPE单核苷酸引物延伸的模板。设计用于Ms—SnuPE延伸的引物的3’端紧邻待测碱基。同时于2个反应体系中加入等量的Taq酶、引物、同位素标记的dCTP或dTTP。这样，如果待测位点被甲基化，则同位素标记的dCTP会在反应延伸时连于引物末端；若是未被甲基化，则标记的dTTP参与反应。末端延伸产物经电泳分离和放射活性测定后可得出C／T值，即为甲基化与非甲基化的比值，从而分析得到待测片段中CpG位点甲基化情况。

3.1.1.2甲基化敏感性内切酶(MSRE)法

MSRE是一类对其识别位点含有甲基化碱基敏感的性内切酶，目前至少已发现320种。此类酶如在其切割位点中含有一个甲基化碱基，则它们中的绝大多数就不能切割DNA。MSRE法是基于甲基化敏感Ⅱ型性内切酶不能切割含有一个或多个甲基化切点序列的基本原理。用甲基敏感Ⅱ型内切酶及其同工酶(对甲基化不敏感)切割含有一个或多个甲基化CpG序列的片段，然后用DNA印迹法分析。此法的最大优点就是无须知道靶DNA一级结构的详细信息，并可提供CpG岛甲基化状态的直接评价，包括取得一些对被检基因甲基化的定量分析信息。但该法除了需要大量的高相对分子质量DNA(≥5ug)外，还只能检测到拷贝数比例大于百分之几的甲基化等位基因，并且仅能提供MSRE识别序列中那些CpG岛甲基化状态的信息。

3.1.1.3甲基化荧光PCR检测

甲基化荧光检测(methylight)是利用荧光定量性PCR检测亚硫酸氢钠处理后的序列改变。在TaqManR技术中，可以使用3种不同的单核苷酸(正义引物、反义引物和荧光杂交探针)，进行不同序列的检测。与已存在的技术相比，甲基化荧光检测最明显的优点就是能同时对几百甚至几千例样品迅速检测。

3.1.1.4酶的区域性甲基化特异性分析(ERMA)

酶的区域性甲基化分析是一种定量区域性CpG甲基化密度研究方法。基因组DNA在亚硫酸氢钠处理后，感兴趣的区域由包含dam位点的引物扩增。扩增后的PCR产物与14C标记的SAM及dam甲基转移酶温育，作为标准DNA定量的内参照。之后将3H标记的SAM和M．SssI甲基转移酶温育。在每个检测中使用具有确定甲基化位点细胞系DNA的标准混合物，每个样品的3H／14C比值转化为所测序列的甲基化密度百分比。该方法不能确定单独CpG位点的甲基化状况。

3.1.1.5亚硫酸氢钠测序法(bisulfite genomic sequencing)

直接测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法。重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。

3.1.2 RNA干扰实验（RNAi）

近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptionalgene silencing, PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默

3.2 信号通路途径

当细胞里要发生某种反应时，信号从细胞外到细胞内传递了一种信息，细胞要根据这种信息来做出反应的现象，叫做信号通路。研究表明 ，化学小分子可通过调节细胞信号通路提高体细胞重编程效率，如激活Wnt等信号通路和抑制MEK-ERK1/2、GSK 和TGF-B等信号通路均提高重编程效率[40]。

3.2.1 PI3K/Akt/mTOR信号通路

3.2.1.1特异性阻断PI3K和mTOR

在培养的HepG2、Hep3B人肝癌细胞株和人正常肝细胞株QSG-7701上，以免疫印迹方法（Western blot）检测各细胞株中PI3K（p110α亚单位）、PTEN、pAkt（S473，T308）和p-mTOR（S2448）的表达情况；分别用 PI3K抑制剂LY294002（50μmol/ml）和mTOR抑制剂Rapamycin（RAPA，50 nmol/ml）孵育HepG2和Hep3B细胞，以MTT比色法检测细胞的增殖能力，以流式细胞术（Flow cytometry）检测细胞周期和凋亡情况，以Western blot法检测细胞中pAkt（S473，T308）和p-mTOR（S2448）的表达改变。

3.2.1.2对HepG2和Hep3B细胞使用阿霉素（Doxorubicin，DOX）单用或与RAPA联合用药

分别取对数生长期的HepG2和Hep3B细胞，以不同浓度的DOX单用或与RAPA（20 nmol/ml）联合应用培养48h或24h，以MTT法测定药物对HepG2和Hep3B细胞的增殖抑制作用，以流式细胞技术检测二者的凋亡情况，以 Western blot法检测者P-p70S6K（T3）、P-4E-BP1（S65）和pS6（S235/236）的表达改变。

3.2.1.3抑制 p53 的表达

3.2.2 TGF-f3/Smad信号通路研究方法

转化生长因子(TGF)-13/Smads信号传导通路是由TGF-B超家族、TGF-B受体，Smad蛋白家族及其核内转录调节因子组成的肿瘤抑制通路。通路中任一元件的异常都可以引起TGF．13/Smads信号传导紊乱，从而导致肿瘤的发生¨ 。研究表明，半数以上的胰腺癌

都有TGF-13/Smads信号传导异常，其发生机制主要包括Smad基因家族突变(主要为Smad4)和表达异常(Smad6，7)，也涉及TGF-B超家族及其受体的改变 J。胰腺上皮内瘤变(pancreaticintraepithelial neoplasia，PanlN)是胰腺癌的癌前病变，它反映了胰腺小导管上皮细胞从不典型增生至原位癌这一系列病变的连续过程 。有研究显示在此过程中也存在着TGF-13/Smads信号传导通路的异常 ]，但因研究仅针对TGF-13/Smads信号传导通路中的个别元件，对于整个TGF-131/Smads信号传导通路的变化规律尚缺乏深入的认识。本研究用组织芯片和免疫组化技术系统地比较研究了不同级别PanIN和胰腺癌组织TGF-13/Smad信号传导通路中相关蛋白的表达，并联系临床病理资料作相关分析，阐明胰腺癌的发病机制。

3.2.3 Wnt/β-catenin信号通路研究方法

Wnt/β-catenin信号转导通路是一条在生物进化中极为保守的通路。在正常的体细胞中，β-catenin只是作为一种细胞骨架蛋白在胞膜处与E-cadherin形成复合体对维持同型细胞的黏附、防止细胞的移动发挥作用。只有当细胞外Wnt信号分子与细胞膜上特异性受体Frizzled蛋白结合激活胞内的dishevelled(散乱的)蛋白导致GSK3B失活，使α-catenin避免被磷酸化而遭降解的命运 , β-catenin才能在胞质中积累起来。当胞质中B-catenin的浓度达到一定水平时, 就可向细胞核转移。在胞核中β-caten in与转录因子家族Tcf /Lefs结合,可激活cyc linD1 和cmyc等原癌基因而导致细胞的增殖、分化、成熟。显然， 在这条信号通路中β-catenin发挥了重要作用,其在胞质中积累继而向胞核的转位,被认为是该信号通路被激活的标志。已有研究证实，Wnt/β-catenin信号通路在人结肠癌、乳腺癌等肿瘤的发生中被激活，但是有关该信号通路在肝癌, 特别是在模型鼠肝癌发生中的作用却少有报道。通过建立大鼠的肝癌模型，以Wnt /β-ca ten in 信号通路中的几个关键因子为研究对象， 探讨它们在正常鼠肝、不典型增生鼠肝和肿瘤肝脏中的表达，以期揭示Wnt/β-catenin信号转导通路与肝肿瘤发生的关系，为临床上肝癌的诊治提供新的线索。

结语

IPS 细胞研究所涉及的技术是基因工程的集大成者，其中变幻莫测的基因导入方法，载体构建，蛋白质重组，物理化学生物方法，无不展示了ips的巨大吸引力，但是直到现

仍存在以下问题亟待解决：a．明晰外界物质参与重编程的详细机制，如

Thiazovivn【41】、维生素C【41】和kenpaullone参与重编程的机制尚不完全清楚；b．控制干细胞自我更新与多能性维持的信号通路错综复杂，有待筛选更高效的提高重编程效率的化学物质；c．诱导物质的毒性要严格检测并克服其毒副作用，如5-AZA 能诱导DNA 损伤，确保瞬时的化学处理不影响iPS 细胞在临床应用；d．用于重编程的药物间有无协同或拮抗作用及作用机制有待研究，这是建立明确成分的化学药物诱导系统的关键．目前，已初步筛选用于重编程的化学物质，最终实现安全型药物诱导技术对体细胞重编程．未来，我们必将阐明体细胞重编程的分子机理，建立可预测、重复性好的药物可诱导技术平台[42-43]

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