氨基酸的薄层层析

实验2 氨基酸的薄层层析 一、目的

熟悉层析技术的一般原理，分类及应用范围。重点掌握薄层层析法的原理及操作技术，用以分离混合氨基酸中各游离氨基酸组分。了解层析技术来分离不同物质的基本原理，以及层析技术的优点。

二、原理

层析法又称色谱法、色层法或层离法，是广泛应用的一种生物化学技术。根据流动相不同分为液相层析和气相层析。

按照层析过程的机理不同，层析法分为以下几种类型：

1、吸附层析：利用吸附剂表面对不同物质吸附性能的差异进行分离。例如活性炭，硅胶等。

2、分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。

3、离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。对于蛋白质、核酸、氨基酸及核苷酸的分离分析有极好的分辨力。

4、凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。例如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶。

5、亲和层析：利用某些蛋白质能与配体分子特异而非共价地结合进行分离。例如酶和抑制剂，抗原和抗体，激素和受体等

按操作形式不同，层析法分为以下几种类型：

1、柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。

2、纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的

目的。

3、薄层层析：薄层层析是一种微量而快速的层离方法，与纸层析方法类似。这

种层析方法是把吸附剂如氧化铝或硅胶涂布于薄板上（玻璃或金

属等）形成薄层，把要分析的样品溶液滴加到薄层的一端，然后在此薄层上用适当的溶剂进行展开即为薄层层析。

本实验中用到薄层层析是一种微量而快速的层离方法。这种层析方法是把吸附剂如氧化铝或硅藻土涂布于薄板上（玻璃或金属等）形成薄层，把要分析的样品溶液滴加到薄层的一端，然后在此薄层上用适当的溶剂进行展开即为薄层层析。本实验中硅胶作为一种固相支持物，它与水有较强的亲和力而与有机溶剂亲和力较弱。层析时吸着在硅胶上的水是固定相，而展层溶剂是流动相。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。

三、实验材料 1．仪器

薄层板：2.5×7.5cm（×1）、毛细管（×3）、研钵（×1）、药匙（×1）、量筒10mL （×1）、小尺子（×1）、层析缸（×1）、电吹风（×1）、喷雾器（×1）、烘箱（200℃）、铅笔。

2. 试剂

（1）1% 脯氨酸水溶液； （2）0.2%亮氨酸水溶液； （3）脯氨酸和亮氨酸的混合溶液； （4）硅胶G（C.P.,层析用）；

（5）粘合剂：0.2%羧甲基纤维素钠（CMCNa）；

（6）层析溶剂：正丁醇（分析纯）﹕冰醋酸（分析纯）﹕乙醇﹕水＝4﹕1﹕1﹕2（V/V），临用时配制。

（7）显色剂：0.2%茚三酮-乙醇溶液。 四、步骤 1、制板：

称取层析用的硅胶G3.2g加8ml 0.2%羧甲基纤维素钠（CMCNa）,在研钵中调成均匀糊状，迅速地倾在玻璃板上（玻璃板要清洁平整，无油污），小心将玻璃板轻轻振荡和倾斜，使硅胶均匀铺在玻璃板上。室温下静置，自然晾干，移至60℃烘箱中烘烤30min，选择厚薄均匀平整的板使用。使用前放入105℃烘箱中烘烤30min活

化（有利于提高硅胶的吸附能力，同时排除硅胶内已吸收的水分和其他气体，通过活化硅胶，主要改变硅胶内部的微孔结构，使其孔径大小及微孔结构排列得到改善）。

2、点样：

活化后的硅胶板室温冷却后，在距底边1.5cm水平线上以间距1cm的宽度确定3个点样点（注意点样点尽量靠近板中心），用毛细管吸取氨基酸样品溶液，垂直轻轻接触薄层表面，每次加样后原点扩散直径不超过2mm，干后再点一次。

3、展层：

将薄板有样品的一端浸入扩展剂，扩展剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿达薄板3/4高度时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线，用热风吹干。

4、显色：

用喷雾器将0.2%茚三酮溶液喷洒在薄板上（注意喷雾器和薄板要保持一定距离，不要使硅胶层吹散，且应喷洒均匀），用热吹风吹干，即可观察到紫红色的氨基酸斑点。用铅笔圈出氨基酸斑点，量出溶剂前沿的距离及各斑点中心与起点之间的距离，并计算各氨基酸的Rf值。

Rf值为迁移率（rate of flow, Rf），在恒定条件下，每种氨基酸有其一定的Rf值。

五、结果计算

Rf= 色斑中心至样品原点中心的距离溶剂前沿至样品原点中心的距离

六、注意事项

1. 在操作过程中，手必须洗净，只能接触薄板的上层边角或用镊子，不能对着薄板说话，以防唾液掉在板上。

2. 点样：点样的次数依照样品溶液的浓度而定，样品量太少时有的成分不易显示，样品量太多时易造成斑点过大，互相交叉或拖尾，不能得到很好的分离。

3. 吹风机温度不宜太高或离得太近，否则斑点变黄。