天然产物合成生物学关键技术

２０１６年１１月ｌ第４ｌ卷第２２期　Ｖｏ１．４１，Ｎｏ．２２　１　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２０１６　天然产物合成生物学关键技术　匡雪君　，邹丽秋　，李滢　，孙超　，陈士林。　（１．中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京１００１９３；　２．中国中医科学院中药研究所，北京１００７００）　［摘要］　结构复杂多样的天然产物是新药发现的重要源泉。通过天然产物合成生物学来实现天然产物的异源合成，被认为　是解决复杂、稀缺天然产物来源问题最具前景的途径。ＤＮＡ组装技术与基因组编辑技术是天然产物合成生物学研究的两大　关键技术。前者可以将多个元件组装成超长ＤＮＡ片段，实现代谢途径的重建，后者可以通过底盘基因组的改造，增加底盘与　外源途径的适配性。该文综述了ＤＮＡ组装技术与基因组编辑技术的最新研究进展，以期为天然产物合成生物学体系的构建　和优化提供帮助。　［关键词］天然产物；合成生物学；ＤＮＡ组装；基因组编辑　Ｋｅｙ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ｉｎ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｎａｔｕｒａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ＫＵＡＮＧ　Ｘｕｅ－ｊｕｎ　，ＺＯＵ　Ｌｉ．ｑｉｕ　，ＬＩ　Ｙｉｎｇ　，ＳＵＮ　Ｃｈａｏ　，ＣＨＥＮ　Ｓｈｉ—ｌｉｎ　（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃｈｉｎａ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｆ　ｏＭｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｏｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００１９３，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｉｓｔｎｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍａｔｅｒｉａ　Ｍｅｄｉｃａ，Ｃｈｉｎａ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｅｓｎｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００７００，Ｃｈｉｎａ）　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｎａｔｕｒａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｗｉｔｈ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ａｎｄ　ｄｉｖｅｒｓｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ａｒｅ　ｔｈｅ　ｍａｊｏｒ　ｓｏｕｒｃｅｓ　ｏｆ　ｎｅｗ　ｄｒｕｇｓ．Ｔｈｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｎａｔｕｒａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｉｓ　ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｏｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｗａｙｓ　ｔｏ　ｓｏｌｖｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｂｌｅｍｓ　ｏｆ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ａｎｄ　ｓｃａｒｃｅ　ｎａｔｕｒａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ＤＮＡ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｔｅｃｈｎｏｌｏ—　ｇＹ　ａｎｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｒｅ　ｔｗｏ　ｋｅｙ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｍｅｒｇｉｎｇ　ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ　ｆｉｅｌｄ　ｏｆ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｎｏ—　ｖｅｌ　ＤＮＡ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌａｓｔ　ｆｅｗ　ｙｅａｒｓ　ｈａｖｅ　ｐａｖｅｄ　ｔｈｅ　ｗａｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ＤＮＡ　ｍｏｌｅ—　ｃｕｌｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｗｈｏｌｅ　ｇｅｎｏｍｅｓ，ｈｅｎｃｅ，ｉｔ　ｃａｎ　ｒｅａｌｉｚｅ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｎｓｔｕｃｔｉｒｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ａｎｄ　ｓｐｅｅｄ　ｕｐ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ．　Ａ　ｗｉｄｅ　ｖａｒｉｅｔｙ　ｏｆ　ｎｅｗ　ｔｏｏｌｓ　ｆｏｒ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｗｉｌｌ　ｂｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｗｉｄｅｌｙ　ｔｏ　ｍｏｄｉｆｙ　ｔｈｅ　ｃｈａｓｓｉｓ　ｇｅｎｏｍｅ　ｔｏ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｉｔｓ　ａｄａｐｔａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｅｘｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｔｈｉｓ　ａｒｔｉｃｌｅ　ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ　ｔｈｅ　ｌａｔｅｓｔ　ａｄｖａｎｃｅ　ｗｉｔｈ　ｒｅｓｐｅｃｔ　ｔｏ　ＤＮＡ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ａｎｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ，ｗｈｉｃｈ　ａｉｍｓ　ｔｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｈｅｌｐ　ｆｏｒ　ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｏｆ　ｎａｔｕｒａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］　ｎａｔｕｒａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ；ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｂｉｏｌｏｇｙ；ＤＮＡ　ａｓｓｅｍｂｌｙ；ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｄｏｉ：１Ｏ．４２６８／ｃｊｃｍｍ２０１６２２０５　种方法　］。　来源于植物、动物、微生物的天然产物往往天然含量低，　组分复杂，提取分离难以得到单一的化合物，采用化学合成　的方法也由于合成路线复杂，反应条件难以控制，合成率低，　无法满足市场需求　。因此，采用合成生物学的方法将外　源的代谢途径引入易于遗传改造的模式微生物中，实现复杂　目前，运用天然产物合成生物学已经成功实现抗疟药青　蒿素＿４　Ｊ、抗癌药紫杉醇　及长春碱　前体的生物合成。要实　现外源途径在底盘系统中的重建并高效合成目标产物离不　开２项关键技术：ＤＮＡ组装技术和基因组编辑技术。前者有　效地弥补了ＤＮＡ化学合成长度的不足，可成功实现长达ｌ　天然产物或其前体的高效生产是目前应用前景最广阔的一　［收稿日期］２０１６４３９－２３　［基金项目］　国家自然科学基金面上项目（８１２７３４８５，８１５７３７０４）　［通信作者］　孙超，Ｔｅｌ：（０１０）５７８３３１９７，Ｆａｘ：（０１０）５７８３３１９７，Ｅ－ｍａｉｌ：ＣＳｌｌｌ３＠ｉｍｐｌａｄ．ａｃ．ｃｎ；　陈士林，Ｔｅｌ：（０１０）５７２０３８７７，Ｆａｘ：（０１０）　５７２０３８７７，Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｌｃｈｅｎ＠ｉｃｍｍ．ａｅ．ａｎ　［作者简介］　匡雪君，硕士研究生，研究方向为天然药物的代谢工程与合成生物学，Ｔｅｌ：（０１０）５７８３３０８５．Ｅ－ｍａｉｌ：ｋｕａｎｇｘｕｅｊｕｎ＠１２６．ｃ０ｍ　・４１１２・　匡雪君等：天然产物合成生物学关键技术　Ｍｂ大片段ＤＮＡ的组装　，从而保障了含多个元件的外源合　成途径的正确组装；后者可以对底盘细胞基因组进行改造，　进行无缝连接　１８　Ｊ。由于Ｇｏｌｄｅｎ　ｇａｔｅ克隆可用于重复序列的　组装，基因组编辑工具转录激活样效应子核酶（ＴＡＬＥＮｓ）蛋　白的ＤＮＡ结合结构域是由序列差异很小的多个模块组成，　所以可以对ＴＡＬＥＮｓ进行人工设计组装　；该方法也可用于　提高与外源途径的适配性，精确外源基因表达，减少中　间产物对宿主的毒性，提高目标产物的产量　Ｊ。　１　ＤＮＡ组装技术　基因环路的构建，陈威华等　使用可识别甲基化序列ｍＣ－　ＮＮＲ（Ｒ＝Ａ或Ｇ）的内切酶ＭｓｐＪ　Ｉ开发ＭＡＳＴＥＲ（ｍｅｔｈｙｌａ—　采用ＤＮＡ从头合成技术产生的ＤＮＡ片段长度大多为　５００～１　０００　ｂｐ，当合成更长的ＤＮＡ片段时则需要将ＤＮＡ小　片段按顺序组装起来，这就涉及ＤＮＡ组装技术　。将基　因元件组装为可复制的和表达的ＤＮＡ分子对于代谢途径或　ｔｉｏｎ—ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｔａｉｌｏｒａｂｌｅ　ｅｎｄｓ　ｒａｔｉｏｎａ１），并利用该方法成功克隆　了２９　ｋｈ的天蓝色链霉菌放线紫红素生物合成基因簇。　ＭＡＳＴＥＲ用含有５－甲基胞嘧啶的引物扩增需要组装的片段，　基因环路的构建是非常关键的，ＤＮＡ组装方法用于基因环路　的设计和特征化不仅有助于细胞内及细胞间机制的理　解，而且能加速途径优化进程；此外，ＤＮＡ组装方法可以通过　激活天然产物生物合成相关的隐藏或沉默的基因簇来发现　新型天然产物…。　。基于不同的机制，ＤＮＡ组装技术可分　为四大类：基于性内切酶的组装、基于寡核苷酸架桥的　组装、基于同源重组的体外组装和基于同源重组的体内　组装。　１．１基于性内切酶的方法　１．１．１依赖于同尾酶的ＢｉｏＢｒｉｃｋ／ＢｇｌＢｒｉｃｋ　同尾酶（如　Ⅱ和ＢａｍＨ　Ｉ，Ｘｂａ　Ｉ和Ｓｐｅ　Ｉ等）是一类识别ＤＮＡ分子中不　同核苷酸序列，但能产生相同黏性末端的性内切酶　。　Ｂｉｏｂｒｉｃｋ是首个实现标准生物元件（如启动子、核糖体结合位　点、开放阅读框、编码序列和终止子等）顺序组装的ＤＮＡ组　装方法　。该法运用酶切和连接不仅能完成标准生物　元件的平台构建，由于元件之间兼容，也能对形成的元件重　新装配，组装成大型ＤＮＡ片段。每个ＤＮＡ元件上游与ＥｃｏＲ　Ｉ和Ｘｂａ　Ｉ酶切位点相邻，下游与Ｓｐｅ　Ｉ和Ｐｓｔ　Ｉ酶切位点相　邻。同尾酶Ｘｂａ　Ｉ和Ｓｐｅ　Ｉ识别不同的酶切位点，产生相同的　黏性末端，一旦２个ＤＮＡ元件连接，元件之间产生疤痕序列　（ＡＣＴＡＧＡ），原来的酶切位点将不复存在，也就不能被原有　的酶所识别，所以连接产物用Ｘｂａ　Ｉ或Ｓｐｅ　Ｉ酶切均不　能将其消化　。需要注意的是元件与质粒骨架上不能有同　尾酶酶切位点。Ｂｉｏｂｒｉｃｋ连接后的疤痕序列（ＡＣＴＡＧＡ）翻译　后为苏氨酸一精氨酸，不会产生移框突变和提前终止，可用于　融合蛋白的表达。近来出现的ＢｇｌＢｒｉｃｋ　改进了原始的　ＢｉｏＢｒｉｃｋ法，ＤＮＡ元件侧翼相邻的是甲基化的不敏感的酶　Ｓｇｌ　Ｕ和ＢａｍＨ　Ｉ，大大提高了连接效率，疤痕序列　（ＧＧＡＴＣＴ）编码甘氨酸－丝氨酸，故ＢｉｏＢｒｉｃｋ也能用于蛋白融　合。ＢｉｏＢｒｉｃｋ和ＢｇｌＢｒｉｃｋ　１次连接２个ＤＮＡ片段，仅利用一　对同尾酶，就可以实现ＤＮＡ片段的多次组装　。　１．１．２　Ｇｏｌｄｅｎ　ｇａｔｅ克隆法Ｇｏｌｄｅｎ　ｇａｔｅ克隆法利用Ⅱ型限　制性内切酶（ⅡＳ型酶，如Ｂｓａ　Ｉ和Ａａｒ　Ｉ）对ＤＮＡ识别序列　的相邻的特定位置进行剪切，利用同种酶产生不同的黏　性末端（４个核苷酸的悬突），消化片段连接的产物没有初始　的酶切位点　。此方法允许３７。酶切消化和１６。连接环化一　步完成，且克服传统多片段组装时酶种类的，还可　性内切酶仅消化目标终端序列，更适于组装长的ＤＮＡ　片段，但是甲基化引物相对昂贵，并且长片段ＤＮＡ的扩增可　能会引人错误。　１．２基于寡核苷酸的架桥法　连接酶循环反应（ｔｈｅ　ｌｉｇａｓｅ　ｃｙｃｌｉｎｇ　ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＬＣＲ）利用　热稳定的连接酶和寡核苷酸进行组装　。ＬＣＲ使用架桥寡　核苷酸连接不具有重复序列的片段，每个架桥寡核苷酸含有　与待连接ＤＮＡ片段末端互补的序列，使上游片段的３　与下　游片段的５　连接，从而使２个ＤＮＡ片段组装成单个的线性　片段　Ｊ。近来，Ｄｅ等运用这项技术将１２个ＤＮＡ片段组装　到一个２０　ｋｂ的质粒上　。　１．３基于体外同源重组的组装　１．３．１重叠延伸ＰＣＲ技术重叠延伸ＰＣＲ技术（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ＰＣＲ，ＳＯＥ—ＰＣＲ），又称交错延伸剪接　ＰＣＲ技术或套叠ＰＣＲ技术　。该技术采用具有互补末端的　引物，使ＰＣＲ产物形成相互重叠的链，在随后的扩增反应中　通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段拼接起来　。　不需要性内切酶消化和连接酶处理就可实现任意２个　目的基因的连接，同时由于不引入目的基因以外的其他序　列，可避免因加入连接序列导致的表达蛋白功能异常　Ｊ。　Ｔａｎ等　利用此技术和长片段ＰＣＲ结合使用，并且在实验　中采用高保真聚合酶ｐｆｕ的校正功能，成功地组装了不同的　长度ＤＮＡ分子，拼接长度可达２０　ｋｂ，融合的错误率仅有　１／１６　６００。此技术可用于２个或２个以上异源基因ＤＮＡ片　段的拼接，并且在插片段的定点突变、敲除基因片段以　及基因的体外分子进化研究上具有独特的优势　Ｊ。　１．３．２序列及连接非依赖性克隆序列及连接非依赖性克　隆法（ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｌｉｇａｔｉｏｎ—ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｌｏｎｉｎｇ，ＳＬＩＣ）利用　Ｔ４ＤＮＡ聚合酶，产生独特的互补末端，然后采用单链退火或　ＲｅｃＡ介导的体外重组，从而实现ＤＮＡ片段的拼接　。　ＳＬＩＣ法虽然１次可组装超过ｌ０个片段，但需要很长的ＤＮＡ　重叠区，如组装４个片段需要至少４０　ｂｐ长的重叠区　。为　了减少重叠区的ＤＮＡ长度，降低引物合成费用，Ｚｈａｎｇ等随　后开发出ＳＬＩＣＥ（ｓｅａｍｌｅｓｓ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｅｘｔｒａｃｔ）方法，采用　廉价的大肠杆菌细胞提取物驱动同源重组介导的ＤＮＡ组　装，极大的减少了花费　Ｊ。　１．３．３　ＵＳＥＲ克隆法采用ＵＳＥＲ（ｕｒａｃｉｌ－ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｅｘｃｉｓｉｏｎ　ｒｅ一　・４１　１３・　２０１６年１１月　第４１卷第２２期　主　凰　垫　悉盎　Ｖｏ１．４１，Ｎ。．２２　Ｉ　Ｎｏｖｅｕｔｂｅｒ，２０１６　ａｇｅｎｔ）克隆法可以实现ＤＮＡ序列与载体的连接　。首先在　载体上加上一小段ｃａｓｓｅｔｔｅ，ｃａｓｓｅｔｔｅ区域含有载体上不存在　的性内切酶识别位点，且在识别位点两端加上２个不同　选可以区分携带组装ＤＮＡ片段的载体与空载体，所以能快　速地完成大规模的阳性菌株的筛选，已经被成功用于３　ｋｂ和　１０　ｋｂ酵母染色体的组装。　除了ＤＮＡ组装，酵母同源重组也常用于将外源ＤＮＡ整　合到基因组上，用于代谢工程与复杂酶途径的构建　。最　近发展起来的ＣａｓＥＭＢＬＲ法能将没有标记的ＤＮＡ片段插入　的碱基对控制方向，反方向的链上加上２个切口酶识别位　点　。改造后的质粒用性内切酶和切口酶处理后，产　生８个碱基对的悬突。组装片段之间共有的重叠片段均以　腺嘌呤起始，并以胸腺嘧啶结束，长度为６～１７　ｂｐ。采用特　定的寡核苷酸来扩增连接片段，重叠区域３　的胸腺嘧啶残基　被尿嘧啶替换，校对聚合酶能读取尿嘧啶碱基（如Ｐｆｕ　Ｔｕｒｂｏ　酵母染色体多个位点，利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统在基因组目标　插入位点引入双链ＤＮＡ断裂，通过同源重组极大的提高了　染色体插入效率，此法已被用于将类胡萝卜素途径中的１５　个基因整合到酵母中３个目标位点和将酪氨酸合成途径中　ｃｘ或Ｐｈｕｓｉｏｎ　Ｕ），然后将质粒骨架、双链ＤＮＡ片段与ＵＳＥＲ　混合酶混合　。混合酶中含有尿嘧啶ＤＮＡ糖苷酶（催化尿　嘧啶的删除，形成一个脱碱基位点）、ＤＮＡ糖苷酶・裂解酶（断　裂磷酸二酯骨架，释放无碱基的脱氧核糖单糖），所有的片段　形成互补的５　悬突，自退火形成带有单链裂痕的环状分子，　然后转化到宿主进行修复　。组装的ＤＮＡ片段之间是无　痕连接，但是用来改造载体的ｃａｓｓｅｔｔｅ会给ＤＮＡ片段与载体　之间带来１３个碱基的疤痕　。　１．３．４　Ｇｉｂｓｏｎ组装Ｇｉｂｓｏｎ组装要求将多个具有重复序列　的ＤＮＡ片段和线性化的载体混合，同时加入３个酶的混合　物，分别为：Ｔ５核酸外切酶（使所有ＤＮＡ片段产生一个３　的　悬突，重叠的部分自动退火）、Ｐｈｕｓｉｏｎ聚合酶（填补和连接缝　隙）和Ｔａｑ连接酶（修复裂痕，产生完整的目标产物）　。　Ｇｉｂｓｏｎ等运用此方法２　ｄ内可将７５个２８４　ｂｐ的ＤＮＡ片段组　装成整个的老鼠线粒体基因组（１６．３　ｋｂ）　。Ｇｉｂｓｏｎ组装方　法不仅可实现无缝拼接，而且组装尺度也十分可观，不仅适　用于以寡核苷酸链为起始的ＤＮＡ合成，也适用于构建长的　ＤＮＡ片段，甚至是基因组　。该法具有快速、简便、易行等　特点，但因其中酶的造价较高，在大规模使用时，不得不考虑　成本。｜ｒ５核酸外切酶可以完全破坏＜２５０　ｂｐ的ＤＮＡ片段，　所以组装的片段长度需＞２５０　ｂｐ。如果片段长度＜２５０　ｂｐ可　以在Ｇｉｂｓｏｎ组装之前使用重叠延伸ＰＣＲ等技术使其长度达　到要求［３７］。　１．４基于体内同源重组的组装　为了组装得到更长的ＤＮＡ序列，除了体外的Ｇｉｂｓｏｎ组　装等方法，科学家们将注意力转移到了体内同源重组，包括　枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和酿酒酵母重组系统。　１．４．１酵母体内组装酵母同源重组频率高，并且拥有精　确的ＤＮＡ修复机制，使其成为同时组装多个ＤＮＡ片段理想　的底盘细胞　。酵母同源重组可以有效连接有４０　ｂｐ重叠　序列的ＤＮＡ片段，Ｋｕｉｊｐｅｒｓ等　改进了这一方法，通过使用　６０　ｂｐ与酵母基因组不同源的重组序列将９个ＤＮＡ片段组　装到一个２１　ｋｂ的质粒上，装配成功率达到９５％。近来，出　现了一个改进的ＲＡＤＯＭ（ｒａｐｉｄ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ　ｍｕｋｉｆｒａｇｍｅｎｔｓ）组装方法　，ＲＡＤＯＭ法将酵母同源重组与　大肠杆菌的蓝白斑筛选结合起来，大大减少了组装时间。通　过提取酵母转化株中的质粒转化肠杆菌，借助蓝白斑筛　・４１　１４・　的１０个酶基因整合到２个目标位点　。　１．４．２枯草芽胞杆菌体内组装杆状的革兰氏阳性菌枯草　芽胞杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ也是合成生物学研究中是一个频繁　使用的宿主。Ｈａｏ等　在芽胞杆菌中建立了一套较为完善　的不同尺度ＤＮＡ组装体系，“Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｉｘ　ｍｅｔｈｏｄ”用于上百　ｋｈ的直接克隆，“Ｄｏｍｉｎｏ　ｍｅｔｈｏｄ”用于几ｋｂ到上百ｋｈ的组　装，“Ｉｎｃｈｗｏｒｍ　ｍｅｔｈｏｄ”用于几Ｍｂ基因组的拼接。枯草芽胞　杆菌基因组（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌ￣ｇｅｎｏｍｅ，ＢＧＭ）载体系统是一个新型　的克隆系统，使用整个枯草芽胞杆菌的基因组作为载体，引　入的外源ＤＮＡ可以以一种单链的形式转化进入枯草芽胞杆　菌细胞质，通过ＲｅｃＡ介导的同源重组将多个大型ＤＮＡ片段　整合到枯草芽胞杆菌染色体上。ＢＧＭ含有４．２　Ｍｂ枯草芽胞　杆菌全基因组，允许大型ＤＮＡ片段的整合。２００５年，ｈａｙａ等　采用“ｉｎｃｈｗｏｒｍ　ｍｅｔｈｏｄ”法成功将集胞藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ基因　组（３．５　Ｍｂ）导入到枯草芽胞杆菌中，构建了１个７．７　Ｍｂ的　集成基因组　Ｊ。然而，该方法需要１００　ｋｂ以上的ＤＮＡ片段　作为模板，其应用受到了。于是，相继开发了“Ｄｏｍｉｎｏ　ｍｅｔｈｏｄ”，借助ＢＧＭ载体系统，利用同源重组原理与逐级添　加模式，已经被用于克隆１６．３　ｋｂ的老鼠线粒体基因组和　１３４．５　ｋｂ的大米叶绿体基因组　Ｊ。“Ｄｏｍｉｎｏ　ｍｅｔｈｏｄ”不要求　纯化长链ＤＮＡ模板，并且促进ＤＮＡ稳定的插人ＢＧＭ，但由　于比较耗时，组装过程需长的同源臂，目前还未得到普遍使　用。２０１０年，Ｉｔａｙａ及其同事们　发现，含有大质粒（＞１００　ｋｂ）的大肠杆菌被噬菌体侵染后，其中的大质粒仍能够稳定　存在。当直接混合大肠杆菌裂解液与芽胞杆菌感受态细胞，　可以将ＤＮＡ大片段稳定整合到芽胞杆菌的基因组上，随即　开发了“ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｉｘ　ｍｅｔｈｏｄ”，利用这种天然转化方式，实现了　ＤＮＡ大片段的直接克隆。　１．４．３大肠杆菌体内组装　和酿酒酵母和枯草芽胞杆菌不　同的是，不能转化线性的ＤＮＡ片段进入大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，因为线性的ｄｓＤＮＡ会被依赖于ＡＴＰ的核酸外切酶　ＲｅｃＢＣＤ分解　。基于Ａ噬菌体Ｒｅｄ重组酶的同源重组系　统频繁被用于将ＤＮＡ整合到大肠杆菌中，介导线性ＤＮＡ分　子与环状的质粒发生同源重组　。Ａ噬菌体主管同源重组　的重组酶系统称为Ｒｅｄ，包含３种蛋白质分子，分别称为　Ｅｘｏ，Ｂｅｔａ和Ｇａｍ。Ｅｘｏ蛋白是具有５　一３　活性的核酸外切酶，　匡雪君等：天然产物合成生物学关键技术　结合到ｄｓＤＮＡ末端，通过消化５　ＤＮＡ末端产生３　ｓｓＤＮＡ悬　突；Ｂｅｔａ蛋白与ｓｓＤＮＡ悬突结合，退火与ｓｓＤＮＡ结合；Ｇａｍ　只有形成二聚体时才能发挥其剪切酶的活性，所以，为了便　于Ｆｏｋ　Ｉ核酸酶的切割结构形成二聚体，通常设计２个结合　位点接近的ＴＡＬＥＮ单体。Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ等　研究发现，２个　ＴＡＬＥＮ单体的靶点间距在１３～３０　ｂｐ时活性比较高，其中间　距为１５　ｂｐ时该核酸酶的活性最高。目前，ＴＡＬＥＮｓ已经在　植物、动物、酵母细胞中得到应用，有潜力成为一种操作方　便、特异性强的基因组定点修饰技术　］。　２．３　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　蛋白抑制核酸外切酶ＲｅｃＢＣＤ结合到ｄｓＤＮＡ的末端　。ｓｓ—　ｂｒｉ等用该系统的ＫＩＫＯ（ｋｎｏｃｋ—ｉｎ／ｋｎｏｃｋ—ｏｕｔ）载体成功将　５．４，７．３，１１．３　ｋｂ的ＤＮＡ片段整合到大肠杆菌基因组中［４９　３。　近来，Ａ噬菌体Ｒｅｄ重组酶介导的同源重组与噬菌体￣ｂ８ＯＩｎｔ　介导的位点特异性同源重组结合的技术也被运用于染色体　整合，如将８　ｋｂ的ＤＮＡ片段整合到大肠杆菌染色体上［５０３。　Ｒａｃ原噬菌体也可用于大片段ＤＮＡ在大肠杆菌中组装。　规律成簇间隔短回文重复（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　Ｒａｃ原噬菌体的ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ重组系统功能上与噬菌体Ａ的　Ｒｅｄ蛋白重组酶系统类似（ＲｅｃＥ和ＲｅｃＴ分别与Ｅｘｏ和Ｂｅｔａ　类似）　。研究显示噬菌体Ａ的Ｒｅｄ蛋白重组酶系统适用　于线性和环状ＤＮＡ分子的结合，而Ｒａｃ的ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ系统　更适用于２个线性ＤＮＡ分子的连接　。　２底盘基因组的编辑技术　采用基因组编辑技术几乎可以对任意基因进行编辑和　修饰　。近年来，基因组范围的高效编辑技术发展迅速，对　宿主基因组的改造效率也不断提升，能更加有效地解决宿主　菌株改造中的许多瓶颈问题，例如：大片段基因组的改造、复　杂表型的改造、基因组上多重位点的组合优化和不需抗生素　进行辅助筛选的高效基因组修饰等　。此外，对宿主基因　组进行适当精简，只保留存活所需的“必须基因”，能大大改　善宿主细胞对底物、能量的利用效率　。　２．１　ＺＦＮｓ　锌指核酸酶（ｚｉｎｃ—ｉｆｎｇｅｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＺＦＮｓ）是第一种通过　人工改造并成功应用的核酸内切酶，由负责ＤＮＡ特异识别　的锌指蛋白（ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＺＦＰ）和Ｆｏｋ　Ｉ核酸内切酶融　合而成　。其Ｎ末端为锌指蛋白ＤＮＡ结合域，由一系列　Ｃｙｓ２一Ｈｉｓ２锌指蛋白串联而成，识别并结合特异的三联体碱　基；Ｃ末端为非特异性核酸内切酶Ｆｏｋ　Ｉ结构域，只有当２个　ＺＦＮ单体同时与各自的ＤＮＡ位点结合时才能形成有切割活　性的Ｆｏｋ　Ｉ二聚体，从而在靶位点将ＤＮＡ切断。由于Ｆｏｋ　Ｉ　内切酶需要形成二聚体方能发挥活性，所以由随意剪切产生　的脱靶几率会大为减少。使用者只需针对目的基因设计８～　１０个锌指结构域，再将这些锌指结构域与核酸内切酶结合，　就构建好了靶向特定位点的ＺＦＮｓｌ５　。ＺＦＮｓ的应用研究开　始较早，目前以其为基础的基因治疗药物已经进入临床研究　阶段，同时，在生物制药领域的应用也比较成熟，但是ＺＦＮｓ　的设计筛选费时费力，而且可能存在一定的脱靶率，使其未　能成为广泛应用的常规技术　。　２．２　ＴＡＬＥＮｓ　转录激活子样效应因子核酸酶（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ—　ｌｉｋｅ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＴＡＬＥＮｓ）与ＺＦＮｓ类似，由转录激活因　子样效应物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ—ｌｉｋｅ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ，ＴＡＬＥ）和Ｆｏｋ　Ｉ核酸酶组成　。ＴＡＬＥ蛋白以重复可变双残基ＲＮＤｓ对应　１个碱基的识别模式结合到靶标ＤＮＡ序列上。Ｆｏｋ　Ｉ核酸酶　ｓｈｏａ　ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　ｒｅｐｅａｔｓ，ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９系统能进行基因组　的高效修饰　。该系统由蛋白质和ＲＮＡ　２个部分组成，蛋　白质即切割ＤＮＡ的Ｃａｓ９核酸内切酶，ＲＮＡ指导Ｃａｓ９核酸　内切酶定位到基因组的靶标位点　。ＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ９系统属　于细菌适应性免疫系统，不同的ＣＲＩＳＰＲ．Ｃａｓ９系统分为３种　类型，类型Ｉ和类型Ⅲ利用多个Ｃａｓ９蛋白引起靶标ＤＮＡ的　断裂，类型Ⅱ只需利用１个Ｃａｓ９内切酶就能在目标基因组　序列引入双链ＤＮＡ断裂，通过与经过特殊设计的小向导　ＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ　ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ）共表达发挥作用　。ＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ９　系统是基因组编辑的一个重要的工具，已经被成功地用于链　霉菌中放线菌紫素合成途径基因簇的失活。对该技术进行　改造产生了ＣＲＩＳ职．ｄＣａｓ９技术，ＣＲＩＳＰＲ—ｄＣａｓ９不切割　ＤＮＡ，而是与转录激活剂或抑制剂蛋白结构域结合，靶标基　因组中相关基因的启动子来激活或抑制基因的表达，故可以　使用这项技术来进行异源宿主中途径产量的优化　。　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统与ＺＦＮｓ和ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９相比，具有更好　的扩展性，且更加经济高效、易于构建。目前此项技术已经　成功地用于天然产物紫色杆菌素合成途径中中间产物和终　产物的优化　。　２．４基于位点特异性重组酶的同源重组　基于位点特异性重组酶的基因组编辑是一个有效的工　具。现在大多利用来源于Ｐ１噬菌体的Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ位点和来源　于酵母的Ｆｌｐ／ＦＲＴ位点催化２个特异ＤＮＡ序列发生重　组　。Ｃｒｅ和Ｆｌｐ都属于酪氨酸重组酶类，分别识别３４　ｂｐ　的目标位点——ｌｏｘＰ和ＦＲＴ，并且催化发生位点特异性重　组　。应用这些重组酶进行基因组编辑，其原理是在基因　组上和目的ＤＮＡ上均插入特异性识别序列，在相应的重组　酶作用下进行重组，实现大片段ＤＮＡ的插入、删除或替换。　在基因组上目的片段两端分别插入２个重组酶识别位点；同　样地，外源片段含有相应重组酶识别位点；通过重组酶的过　量表达，即可实现２个特异识别位点之间基因组ＤＮＡ的替　换操作　。Ｃｒｅ—ｌｏｘＰ重组系统在酿酒酵母中已经使用得比　较成熟，已被成功用于引起单基因或者双基因的删除，也能　用于大肠杆菌中基因的删除　。　２．５基于转座子的同源重组　转座子（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）是存在于ＤＮＡ上可自主复制和移位　的基本单位　。转座子分为简单转座子和复合式转座子。　．４】１５・　２０１６年１１月１第４１卷第２２期　恩　曼　盎盎　Ｖｏ１．４１，Ｎｏ．２２　ｌ　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２０１６　简单转座子因没有任何宿主基因，被直接称为插入序列，是　染色体或质粒ＤＮＡ的正常组成部分　。插入序列都是可　［９］　Ｂａｃｋ　Ｃ　Ｈ，Ｌｉｓｓ　Ｍ，Ｃｌａｎｅｙ　Ｋ．ＤＮＡ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｔｏｏｌｓ　ａｎｄ　ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｓｐｅｃｔｒ，２０１４，ｄｏｉ：　１０．１　１２８／ｍｉｃｒｏｂｉｏ／ｓｐｅｃ．ＰＬＡＳ－００１４－２０１３．　以存在的单元，带有协助自身移动的蛋白；复合式转座　子是另一类带有某些抗药性基因或其他宿主基因的转座子，　其两翼往往是２个相同或高度同源的插入序列。基因转座　［１０］　Ｃｏｂｂ　Ｒ　Ｅ，Ｎｉｎｇ　Ｊ　Ｃ，Ｚｈａｏ　Ｈ．ＤＮＡ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｎａｔｕｒａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有　一［Ｊ］．Ｊ　Ｉｎｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４，４１（２）：４６９．　段３一ｌ２　ｂｐ的靶序列ＤＮＡ会自我复制，使插入的转座子　［１１］Ｅｌｌｉｓ　Ｔ，Ａｄｉｅ　Ｔ，Ｂａｌｄｗｉｎ　Ｇ　Ｓ．ＤＮＡ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆｒ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｂｉｏｌｏ—　ｇｙ：ｒｆｏｍ　ｐａｒｔｓ　ｔｏ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ａｎｄ　ｂｅｙｏｎｄ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｇｒ　Ｂｉｏｌ　Ｃａｍｂ，　２０１１，３（２）：１０９．　位于２个重复的靶序列之间　。不同转座子的靶序列长度　不同，但对于一个特定的转座子来说，所复制的靶序列长度　都是一样的。对于序列已知的目的基因，可利用转座子将该　［１２］Ｐａｔｏｎ　Ｎ　Ｊ．ＤＮＡ　ａｓｒｓｅｍｂｌｙ　ｆｏｒ　ｐｌａｎｔ　ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　ｔｏｏｌｓ　［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ，２０１４，１９：１４．　片段引入宿主细胞内，然后筛选突变的ＤＮＡ序列替换野生　型亲本ＤＮＡ序列，通过对突变基因的测试来研究相关基因　的功能　。　３展望　近年来，ＤＮＡ合成与组装技术发展迅速，已在合成生物　学、遗传网络设计和基因组合成方面获得了广泛的应用。但　是目前的ＤＮＡ合成与组装技术也存在一些问题，例如通量　低、错误率高、自动化程度低、成本高等，通过学科间的交叉　合作，开发新的合成策略，研制新的试剂或酶，有望加快ＤＮＡ　组装技术的研究进程。同时，新型基因组编辑技术也不断推　陈出新，在基因组改造和优化方面表现出巨大的潜力和广阔　的应用前景。但这些技术的快速发展也面临一些问题，如一　些高效的基因组编辑技术只能在少数遗传操作的模式菌中　应用，难以应用到其他微生物。随着ＤＮＡ组装技术和基因　组编辑技术的不断发展和完善，两者将会在合成生物学和其　他生命科学领域研究与应用中发挥更重要的作用。　［参考文献］　［１］Ｄｉｎｇ　Ｙ，Ｄｉｎｇ　Ｃ，Ｙｅ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｎａｔ—　ｕｒａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｒｉｄｏｎｉｎ—ｉｎｓｐｉｒｅｄ　ａｎｔｉｃａｎｃｃｒ　ａｇｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ，２０１６，１２２：１０２．　［２］　李艺，蒋建东．中国药用天然产物有效成分的代谢研究进展　［Ｊ］．中国中药杂志，２０１０，３５（２３）：３２２３．　［３］　ＭａｃＤｏｎａｌｄ　Ｉ　Ｃ，Ｄｅａｎｓ　Ｔ　Ｌ　Ｔｏｏｌｓ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ａｄｖ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖ　Ｒｅｖ，２０１６（１６）：３０２４０．　［４］　向礼恩，严铮辉，王贵君．青蒿素生物合成途径基因组织表　达分析与青蒿素积累研究［Ｊ］．中国中药杂志，２０１２，３７　（９）：１１６９．　［５］　Ｅｎｇｅｌｓ　Ｂ，Ｄａｈｍ　Ｐ，Ｊｅｎｎｅｗｅｉｎ　Ｓ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　ｔａｘａ－　ｄｉｅｎｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ　ａｓ　ａ　ｆｉｒｓｔ　ｓｔｅｐ　ｔｏｗａｒｄｓ　ｔａｘｏｌ（ｐａｃｌｉｔａｘ—　ｅ１）ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］，Ｍｅｔａｂ　Ｅｎｇ，２００８，１０（３／４）：２０１．　［６］Ｂｒｏｗｎ　Ｓ，Ｃｌａｓｔｒｅ　Ｍ，Ｃｏｕｒｄａｖａｕｌｔ　Ｖ，ｅｔ　１ａ．Ｄｅ　ｎｏｙｏ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ－ｄｅｉｒｖｅｄ　ａｌｋａｌｏｉｄ　ｓｔｒｉｃｔｏｓｉｄｉｎｅ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２０１５，１１２（１１）：３２０５．　［７］Ｇｉｂｓｏｎ　Ｄ　Ｇ，Ｇｌａｓｓ　Ｊ　Ｉ，Ｌａｒｔｉｇｕｅ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｃｒｅａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｂｙ　ａ　ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２０１０，３２９（５９８７）：５２．　［８］　Ｃｓ６ｒｇ￣ｉ　Ｂ，Ｎｙｅｒｇｅｓ　ｄ，Ｐ６ｓｆａｉ　Ｇ．Ｓｙｓｔｅｍ－ｌｅｖｅｌ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｉｎ　ｍｉｃｒｏｂｅｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｔ　Ｏｐｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１６，３３：１１３．　・４１　１６・　［１３］Ｒｏｋｋｅ　Ｇ，Ｋｏｒｖａｌｄ　Ｅ，Ｐａｈｒ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．ＢｉｏＢｒｉｅｋ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｓｔａｎｄａｒｄｓ　ａｎｄ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｔｏｏｌｓ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，２０１４，１１１６：１．　［１４］Ｂｏｙｌｅ　Ｐ　Ｍ，Ｂｕｒｒｉｌｌ　Ｄ　Ｒ，Ｉｎｎｉｓｓ　Ｍ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ＢｉｏＢｒｉｃｋ　ｃｏｍｐａｔｉ－　ｂｌｅ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｅｎｇ，　２０１２，６（１）：８．　［１５］Ｈｏ—Ｓｈｉｎｇ　０，Ｌａｕ　Ｋ　Ｈ，Ｖｅｒｎｏｎ　Ｗ，ｅｔ　ａ１．Ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ｓｔａｎｄａｒｄ－　ｉｚｅｄ　ＤＮＡ　ｐａｒｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ＢｉｏＢｒｉｃｋ　ｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，２０１２，８５２：６１．　［１６］Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｊ　Ｃ，Ｄｕｅｂｅｒ　Ｊ　Ｅ，ＬｅｇｕｉａＭ，ｅｔ　ａ１．ＢｇｌＢｒｉｃｋｓ：ａｆｌｅｘｉｂｌｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｆｏｒ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐａｒｔ　ａｓｓｅｍｂｌｙ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｅｎｇ，２０１０，４　（１）：１．　［１７］ＥｎｇｌｅｒＣ，ＫａｎｄｚｉａＲ，Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ　Ｓ．Ａ　ｏｎｅ　ｐｏｔ，ｏｎｅ　ｓｔｅｐ，ｐｒｅｃｉ—　ｓｉｏｎ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ［Ｊ］．ＰＬｏＳ　ＯＮＥ，２００８，３（１１）：ｅ３６４７．　［１８］Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ　Ｓ，Ｗｅｒｎｅｒ　Ｓ．Ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ｍｕｈｉｇｅｎｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ｇｏｌｄｅｎ　ｇａｔｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，２０１５，１３２１：２６９．　［１９］Ｅｎｇｌｅｒ　Ｃ，Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ　Ｓ．Ｇｏｌｄｅｎ　ｇａｔｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，２０１４，１１１６：１１９．　［２０］Ｃｈｅｎ　Ｗ　Ｈ，Ｑｉｎ　ｚ　Ｊ，Ｗａｎｇ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ＭＡＳＴＥＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ—　ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｔａｉｌｏｒａｂｌｅ　ｅｎｄｓ　ｒａｔｉｏｎａ１）ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｓｅａ　ｍｌｅｓｓ　ＤＮＡ　ａｓｓｅｍｂｌｙ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，２０１３，４１（８）：ｅ９３．　［２１］Ｐａｃｈｕｋ　Ｃ　Ｊ，Ｓａｍｕｅｌ　Ｍ，Ｚｕｒａｗｓｋｉ　Ｊ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｃｌｏ．　ｎｉｎｇ：ａ　ｏｎｅ—ｓｔｅｐ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ＤＮＡ　ｒｆａｇｍｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，２０００，２４３（１／２）：１９．　［２２］Ｚｅｂａｌａ　Ｊ　Ａ，Ｂａｒａｎｙ　Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｌｉｇａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，１９９３，１７（２）：　１７１．　［２３］ｄｅ　Ｋｏｋ　Ｓ，Ｓｔａｎｔｏｎ　Ｌ　Ｈ，Ｓｌａｂｙ　Ｔ，ｅｔ　１ａ．Ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｒｅｌｉａｂｌｅ　ＤＮＡ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｖｉａ　ｌｉｇａｓｅ　ｃｙｃｌｉｎｇ　ｒｅａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡＣＳ　Ｓｙｎｔｈ　Ｂｉｏｌ，２０１４，　３（２）：９７．　［２４］Ｘｕ　Ｔ，Ｌｉ　Ｘ，Ｗｕ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｆｏｒ　ｃｏｎｓｔｕｒｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅｐｔｉｄｅ－ｆ２ｍ—Ｈ－２Ｋｂ　ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　ｗｉｔｈ　ｏｖｅｄａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ｏｎｅ　ｓｔｅｐ　ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｊ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ，２０１６，ｄｏｉ：　１０．４０１４／ｊｍｂ．１６０６．０６０３８．　［２５］　Ｓｉｎｇｈ　Ｐ，Ｐｕｎｊａｂｉ　Ｍ，Ｊｏｌｌｙ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓ—　ｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｄｏｎ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｐｈｙｔａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ［Ｊ］．Ｉｎ－　ｄｉａｎ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ，２０１３，５０（６）：５３７．　［２６］Ｔａｎ　Ｌ，Ｃｈｅｎ　Ｈ，Ｙｕ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ＳＯＥ—ＰＣＲ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ　匡雪君等：天然产物合成生物学关键技术　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎｔｏ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ　ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ　［Ｊ］．Ｊ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１３，９４（２）：１１７．　［２７］Ｌｊ　Ｍ　ｚ，Ｅｌｌｅｄｇｅ　Ｓ　Ｊ．Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｏ　ｇｅｎｅｒａｔｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　ｖｉａ　ＳＬＩＣ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　２００７，４（３）：２５１．　［２８］Ｈｉｌｌ　Ｒ　Ｅ，Ｅａｔｏｎ－Ｒｙｅ　Ｊ　Ｊ．Ｐｌａｓｍｉｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ＳＬＩＣ　ｏｒ　ｓｅ—　ｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，　２０１４，１１１６：２５．　［４２］ＪａｋｏＳｉｉｆｎａｓ　Ｔ，Ｒａｊｋｕｍａｒ　Ａ　Ｓ，Ｚｈａｎｇ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．ＣａｓＥＭＢＬＲ：Ｃａｓ９一　ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ　ｍｕｌｔｉｌｏｃｉ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎ　ｒｉｖｅ　ａｓｓｅｍｂｌｅｄ　ＤＮＡ　ｐａｒｔｓ　ｉｎ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［Ｊ］．ＡＣＳ　Ｓｙｎｔｈ　Ｂｉｏｌ，２０１５，４　（１１）：１２２６．　［４３］Ｈａｏ　Ｔ，Ｈａｎ　Ｂ，Ｍａ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎ　ｓｉｌｉｃｏ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ｆｏｒ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ，Ｅｇｌ－２３７，　（Ｒ，Ｒ）－２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ　ａｎｄ　ｉｓｏｂｕｔａｎｏｌ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｂｉｏｓｙｓｔ，２０１３，　９（８）：２０３４．　［２９］　Ｚｈａｎｇ　Ｙ，Ｗｅｒｌｉｎｇ　Ｕ，Ｅｄｅｌｍａｎｎ　Ｗ．ＳＬＩＣＥ：ａ　ｎｏｖｅｌ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｅｌｌ　［４４］　Ｉｔａｙａ　Ｍ，Ｔｓｕｇｅ　Ｋ，Ｋｏｉｚｕｍｉ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ　ｔｗｏ　ｇｅｎｏｍｅｓ　ｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔ—ｂａｓｅｄ　ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　２０１２，４０（８）：ｅ５５．［３０］Ｚｈａｎｇ　ｚ，Ｙａｎｇ　Ｊ，Ｂａｆｏｒｄ　Ｄ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｃｏｎ－　ｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｈｉｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ＵＳＥＲ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｎｓｅｃｔ　ｃｅｌｌ－ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１６，９５：１３．　［３　１］　Ｗａｎｇ　Ｓ，Ｌｉ　Ｗ，Ｗａｎｇ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｉｒｐｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｇｅｎｅｓ　ｂｙ　ＵＳＥＲ　ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｊ　Ｇｅｎｅｔ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１４，４１（６）：３３９．　［３２］　Ｓａｌｏｍｏｎｓｅｎ　Ｂ，Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ　Ｕ　Ｈ，Ｈａｌｋｉｅｒ　Ｂ　Ａ．ＵＳＥＲ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｃｌｏ一　ｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｐｉｒｍｅｒ　ｄｅｓｉｇｎ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，　２０１４，１　１　１６：５９．　［３３］Ｗａｎｇ　Ｒ　Ｙ，Ｓｈｉ　ｚ　Ｙ，Ｇｕｏ　Ｙ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｎｉｃｋｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．ＰＬｏＳ　ＯＮＥ，２０１３，８（３）：　ｅ５７９４３．　［３４］　ＭｃＡｆｌａｓｔｅｒ　Ｍ　Ｒ，Ｓｉｎｃｌａｉｒ—Ｄａｖｉｓ　Ａ　Ｎ，Ｈｉｌｔｏｎ　Ｎ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｕｎｉ　ｉｆｅｄ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏｗａｒｄｓ　Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｂｒｕｃｅｉ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｇｅｎｏｍｉｅｓ　ｕｓｉｎｇ　Ｇｉｂｓｏｎ　ａｓｓｅｍｂｌｙ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ，２０１６，ｄｏｉ：　１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｂｉｏｐａｒ￣２０１６．０８．００１．　［３５］　Ｇｉｂｓｏｎ　Ｄ　Ｇ，Ｓｍｉｔｈ　Ｈ　Ｏ，Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ　Ｃ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｙｎ—ｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　２０１０，７（１１）：９０１．　［３６］Ｇｉｂｓｏｎ　Ｄ　Ｇ，Ｙｏｕｎｇ　Ｌ，Ｃｈｕａｎｇ　Ｒ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｕｐ　ｔｏ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｈｕｎｄｒｅｄ　ｋｉｌｏｂａｓｅｓ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００９，６（５）：３４３．　［３７］Ｂｏｒｄａｔ　Ａ，Ｈｏｕｖｅｎａｇｈｅｌ　Ｍ　Ｃ，Ｇｅｒｍａｎ—Ｒｅｔａｎａ　Ｓ．Ｇｉｂｓｏｎ　ａｓｓｅｍ一　ｂｌｙ：ａｎ　ｅａｓｙ　ｗａｙ　ｔｏ　ｃｌｏｎｅ　ｐｏｔｙｖｉｒａｌ　ｆｕｌｌ—ｌｅｎｇｔｈ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｅＤＮＡ　ｃｌｏｎｅｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ａｎ　ｅｃｔｏｐｉｃ　ＶＰｇ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌ　Ｊ，２０１５，１２：８９．　［３８］Ｌｉｓｂｙ　Ｍ，Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ　Ｒ．Ｃｅｌｌ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｍｉｔｏｔｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔ　Ｂｉｏｌ，２０１５，７（３）：ａ０１６５３５．　［３９］Ｋｕｉｊｐｅｒｓ　Ｎ　Ｇ，Ｓｏｌｉｓ—Ｅｓｃａｌａｎｔｅ　Ｄ，Ｂｏｓｍａｎ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｖｅｒｓａｔｉｌｅ，　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｆｏｒ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉ—ｆａｒｇｍｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｉｎ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｈｉａｅ　ｕｓｉｎｇ　６０　ｂｐ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂ　Ｃｅｌｌ　Ｆａｃｔ，２０１３，１２：４７．　［４Ｏ］Ｌｉｎ　Ｑ，Ｊｉａ　Ｂ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ　Ｌ　Ａ，ｅｔ　ａ１．ＲＡＤＯＭ，ａｎ　ｅｆｉｆｃｉｅｎｔ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｕｐ　ｔｏ　１０　ｋｂ　ｌｏｎｇ　ｉｎ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［Ｊ］．ＡＣＳ　Ｓｙｎｔｈ　Ｂｉｏｌ，２０１５，４（３）：　２１３．［４１］Ｃａｕｗｏｏｄ　Ｊ　Ｄ，Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ａ　Ｌ，Ｗｉｄｇｅｒ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｐａｒｔｎｅｒ　ｃｈｏｉｃｅ　ｉｎ　ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　ｍｉｔｏｔｉｃ　ｒｅｅｏｍ－ｂｉｎａｔｉｏｎ　ｆＪ］．ＰＬｏＳ　Ｇｅｎｅｔ，２０１３，９（１１）：ｅ１００３９３１．　ｏｎｅ　ｃｅｌｌ：ｓｔａｂｌｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔ￣ＰＣＣ６８０３　ｇｅｎｏｍｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌ￣１６８　ｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｅ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，　２００５，１０２（４４）：１５９７１．　［４５］　Ｙａｄａｖ　Ｔ，Ｃａｒｒａｓｃｏ　Ｂ，Ｓｅｒｒａｎｏ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｒｏｌｅｓ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＤｐｒＡ　ａｎｄ　ＳｓｂＡ　ｉｎ　ＲｅｃＡ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２０１４，２８９（４０）：２７６４０．　［４６］ｈａｙａ　Ｍ，Ｋａｎｅｋｏ　Ｓ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔａｂｌｅ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ＤＮＡ　ｒｅ—　ｌｅａｓｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｅｌｌ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｓｕ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ｇｅｎｏｍｅ　ｖｅｃｔｏｒ　ｂｙ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｉｘ　ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，２０１０，３８（８）：　２５５　１．　［４７］　Ｊｕｈａｓ　Ｍ，ＲｅｕＢ　Ｄ，Ｚｈｕ　Ｂ，ｅｔ　ａ１．Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ａｎｄ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒｉｅｓ　ａｆｔｅｒ　ｏｎｅ　ｄｅｃａｄｅ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１４，１６０（Ｐｔ　１１）：　２３４１．　［４８］ｉｊｉｋｕｍａｒ　Ｐ　Ｋ，Ｘｉａｏ　Ｗ　Ｈ，Ｔｙｏ　Ｋ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔａｘｏｌ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０，３３０（６０００）：７０．　［４９］Ｓａｂｒｉ　Ｓ，Ｓｔｅｅｎ　Ｊ　Ａ，Ｂｏｎｇｅｒｓ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｋｎｏｃｋ－ｉｎ／Ｋｎｏｃｋ—ｏｕｔ（ＫＩ－　ＫＯ）ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌａｒｇｅ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｉｎｃｌｕ一　ｄｉｎｇ　ｗｈｏｌｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｐａｔｈｗａｙｓ，ｏｎｔｏ　ｔｈｅ　Ｅｓｃｈｅｎｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｃｈｒｏｍｏ—　ｓｏｍｅ　ａｔ　ｗｅｌｌ—ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｅｄ　ｌｏｃｉ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂ　Ｃｅｌｌ　Ｆａｃｔ，２０１３，１２：　６０．　［５０］Ｚｈｏｕ　Ｌ，Ｎｉｕ　Ｄ　Ｄ，Ｔｉａｎ　Ｋ　Ｍ，ｅｔ　１ａ．Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　ｓｗｉｔｃｈｅｄ　Ｄ—ｌａｃ—　ｔａｔｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｎｃｈｉａ　ｃｏｌｉ［Ｊ］．Ｍｅｔａｂ　Ｅｎｇ，２０１２，１４　（５）：５６０．　［５１］Ｚｈａｎｇ　Ｙ，Ｂｕｃｈｈｏｌｚ　Ｆ，Ｍｕｙｒｅｒｓ　Ｊ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｎｅｗ　ｌｏｇｉｃ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ，１９９８，２０（２）：１２３．　［５２］　Ｆｕ　Ｊ，Ｂｉａｎ　Ｘ，Ｈｕ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｆｕｌｌ—ｌｅｎｇｔｈ　ＲｅｃＥ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｌｉｎｅａｒ－ｌｉｎ—　ｅａｒ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ　ｄｉｒｅｃｔ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｆｏｒ　ｂｉｏｐｒｏｓｐｅｃｔｉｎｇ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１２，３０（５）：４４０．　［５３］　ＯＭｏｎ　Ｊ，Ｇａｎｔｎｅｒ　Ｊ，Ｋｅｍｎａ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ　ｐｌａｎｔｓ　ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ　ａ　ｕｓｅｒ－・ｆｒｉｅｎｄｌｙ　ｇｅ－　ｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｔｏｏｌｋｉｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，２０１６，ｄ０ｉ：１０．１１１１／　ｔｐｊ．１３３１９．　［５４］Ｓｔｒｏｎｇ　Ａ，Ｍｕｓｕｎｕｒｕ　Ｋ．Ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｉｎ　ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｉｓｅａ－　ｓｅｓ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｃａｒｄｉｏｌ，２０１６，ｄ０ｉ：１０．１０３８／ｎｒｃａｒ－　ｄｉｅ．２０１６．１３９．　［５５］Ｍｅｄｉｎ　Ｃ，Ｂｅａｖｅｒ　Ｌ　Ｅ，Ｔａｙｌｏｒ　Ｏ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｉｆｃｉｅｎｔ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｍｕ　ｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｎａｒｃｈ　ｂｕｔｔｅｒｌｆｙ　ｕｓｉｎｇ　ｚｉｎｃ－ｉｆｎｇｅｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅｓ　［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ，２０１３，２３（１）：１５９．　・４１１７・　２０１６年１１月１第４ｌ卷第２２期　主　曼　焘盎　Ｖｏ１．４１，Ｎｏ．２２　１　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２０１６　［５６］Ｐｅｔｏｌｉｎｏ　Ｊ　Ｆ．Ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ　ｖｉａ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅｓ［Ｊ］．Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅｖ　Ｂｉｏｌ　Ｐｌａｎｔ，２０１５，５１（１）：Ｉ．　［５７］Ｐｅｔｅｒｓｅｎ　Ｂ，Ｎｉｅｍａｎｎ　Ｈ．Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆａｒｍ　ａｎｉｍａｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ｚｉｎｃ－ｉｆｎｇｅｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＺＦＮ）［Ｊ］．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　Ｒｅｓ，２０１５，２３（１）：７．　［５８］Ｗｃｎｄｔ　Ｔ，Ｈｏｌｍ　Ｐ　Ｂ，Ｓｔａｒｋｅｒ　Ｃ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．ＴＡＬ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅｓ　ｉｎｄｕｃｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ａｔ　ａ　ｐｒｅ・－ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｌｏｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｏｆ　ｐｒｉ－　ｍａｒｙ　ｂａｒｌｅｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，２０１３，８３（３）：　２７９．　［５９］Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ　Ｍ，Ｑｉ　Ｙ，Ｚｈａｎｇ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆＡｒａ—　ｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ｕｓｉｎｇ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　ＴＡＬ　ｅｆｆｅｅｔｏｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅｓ［Ｊ］．　Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ），２０１３，３（１０）：１６９７．　［６Ｏ］Ｂｅｕｍｅｒ　Ｋ　Ｊ，Ｔｒａｕｔｍａｎ　Ｊ　Ｋ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｍｐａｉｒｎｇ　ｚｉｎｃ　ｉｆｎｇｅｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅｓ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｎｌｌｅｌｅａｓｅｓ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｉｎ　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ［Ｊ］．Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ），２０１３，３　（１Ｏ）：１７１７．　［６１］ｄｅ　Ｓｏｌｉｓ　Ｃ　Ａ，Ｈｏ　Ａ，Ｈｏｌｅｈｏｎｎｕｒ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｖｉｒａｌ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍ　ｗｉｔｈ　ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｇＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｆｏｒ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　［Ｊ］．Ｆｒｏｎｔ　Ｍｏｌ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１６，９：７０．　［６２］Ｔｙｃｋｏ　Ｊ，Ｍｙｅｒ　Ｖ　Ｅ，Ｈｓｕ　Ｐ　Ｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　ＣＲＩＳＰＲ—　Ｃａｓ９　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ，２０１６，６３（３）：　３５５．　［６３］　Ｋｏｃｈ　Ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ａ　ｎｅｗ　ｐｌａｙｅｒ　ｉｎ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｇｅｎｅｔ，２０１６，１７（７）：３７５．　・４１１８・　［６４］Ｃｏｎｇ　Ｌ，Ｒａｎ　Ｆ　Ａ，Ｃｏｘ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３３９（６１２１）：　８１９．　［６５］Ｌｉｕ　Ｚ，Ｘｉｅ　Ｙ，Ｚｈａｎｇ　Ｘ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌａｒｇｅ　ｇｅ・　ｎｏｍｉｃ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｉｎ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ｂｙ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｔｉｒｐｌｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，　２０１６，７２（４）：４６５．　［６６］Ｐｅｓｃｈｋｅ　Ｋ，Ｄｕｄｅｃｋ　Ａ，Ｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ—ｂａｓｅｄ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌｓ　ｏｆ　ｍａｓｔ　ｃｅｌｌ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ａｎｄ　ｍａｓｔ　ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｇｃｎｅ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，２０１５，１２２０：４０３．　［６７］Ｗａｍｐｆｌｅｒ　Ｐ　Ｂ，Ｆａｓｏ　Ｃ，Ｈｅｈｌ　Ａ　Ｂ．Ｔｈｅ　Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　Ｇｉａｒ－　ｄｉａ　ｌａｍｂｌｉａ：ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ａ　ｂｉｎｕｃｌｅａｔｅ　ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ　ｐｒｏｔｏ－　ｚｏａｎ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｐａｒａｓｉｔｏ１．２０１４，４４（８）：４９７．　［６８］Ｌｉｎ　Ｔ，Ｔｒｏｙ　Ｅ　Ｂ，Ｈｕ　Ｌ　Ｔ，ｅｔ　１ａ．Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ａｓ　ａｎ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｆｒｏｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ，２０１４，４：６３．　［６９］Ｓｋｉｐｐｅｒ　Ｋ　Ａ，Ａｎｄｅｒｓｅｎ　Ｐ　Ｒ，Ｓｈａｒｍａ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．ＤＮＡ　ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ—　ｂａｓｅｄ　ｇｅｎｅ　ｖｅｈｉｃｌｅｓ—ｓｃｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ａｎ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｄｒｉｖｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉ—　ｏｍｅｄ　Ｓｃｉ，２０１３，２０：９２．　［７Ｏ］Ｄｉ　Ｍａｔｔｅｏ　Ｍ，Ｂｅｌａｙ　Ｅ，Ｃｈｕａｈ　Ｍ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｃｅｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ｅｘｐｅｔｒ　Ｏｐｉｎ　Ｂｉｏｌ　Ｔｈｅｒ，　２０１２，１２（７）：８４１．　［７１］　Ｍｅｉｒ　Ｙ　Ｊ，Ｗｕ　Ｓ　Ｃ．Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ－ｂａｓｅｄ　ｖｅｃｔｏｒ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｆｏｒ　ｇｃｎｅ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｔｉｒａｌｓ：ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｃｈａｎｇ　Ｇｕｎｇ　Ｍｅｄ　Ｊ，２０１１，３４（６）：５６５．　［责任编辑孔晶晶］