第３１卷第４期 ２０１４年８月 甘肃中医学院学报 Ｊ．ＧＡＮＳＵ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＴＣＭ Ｖｏｌ＿３１ Ｎｏ．４ Ａｕｇ．２０１４ ＰＩ对肿瘤细胞抑制作用的研究 白璧辉，苏凯堂，宋永嘉 （甘肃中医学院，甘肃指导 陈兰州彻 ７３００００） 摘要：目的通过研究３，４，６，７，１２，１２ｂ－，－￣，氢吡嗪［１’，２’：１，２］吡啶并［３，４一ｂ］吲哚一１（２Ｈ）一酮（ＰＩ） 采用四甲基偶氮唑 的细胞毒抗肿瘤作用，探宄ＰＩ是否可作为具可修饰性的新型抗肿瘤先导化合物。方法盐比色法（ＭＴＴ法）研究ＰＩ和Ｆａｓｃａｐｌｙｓｉｎ（Ｆ）对人肝癌细胞（Ｂｅｌ一７４０２）、人宫颈癌细胞（Ｈｅｌａ）、人乳腺癌细 胞（Ｔ４７Ｄ）和小鼠红白血病细胞（ＭＥＬ）等肿瘤细胞的增殖抑制作用并进行对比，并选取Ｈｅｌａ细胞观察ＰＩ处 理Ｈｅｌａ细胞后的形态学变化。结果ＰＩ和Ｆ药理活性有相似性，在低质量浓度时，ＰＩ对ＨｅＬａ细胞生长的 抑制作用比Ｆ的抑制作用显著，同时ＰＩ对Ｈｅｌａ细胞的抑制作用具有量效关系；ＰＩ处理ＨｅＬａ细胞后的形态 学变化具有典型细胞凋亡的形态学特征。结论ＰＩ通过诱导肿瘤细胞凋亡产生细胞毒抗肿瘤作用。 关键词：３，４，６，７，１２，１２ｂ一六氢吡嗪［１’，２’：１，２］吡啶并［３，４－ｂ］吲哚一１（２Ｈ）一酮；抗肿瘤；细胞毒 中图分类号：Ｒ２８５．５文献标志码：Ｂ文章编号：１００３—８４５０（２０１４）０４—００１１一Ｏ４ 海洋活性物质Ｆａｓｃａｐｌｙｓｉｎ（Ｆ）是从海绵中发现的一种吲哚生物碱类化合物（如图１ ａ所示）。已有 研究表明，Ｆ可通过其平面芳香稠环结构对肿瘤细 胞的ＤＮＡ嵌入，改变ＤＮＡ的构象，从而阻止肿瘤细 胞ＤＮＡ的复制，是很有潜力的抗肿瘤化合物，然而 ４－ｂ］吲哚一１（２Ｈ）一酮（Ｐｔ）与Ｆ化学结构的基本骨 架相似，但ＰＩ比Ｆ少１个六元环，结构更简单，同时 多１个更具可修饰性的化学官能团（如图１ ｂ所 示）。然而对其抗肿瘤作用，国内、外尚未见文献报 道。因此本文对ＰＩ的体外抗肿瘤细胞毒作用进行 Ｆ的毒副作用较大。改变Ｆ平面结构可降低毒性， 但是其衍生物对于肿瘤细胞的特异性抑制也大幅降 了初步研究，以便发现更具可修饰性的新型抗肿瘤 先导化合物，为寻找高效、高选择性而低毒的抗肿瘤 低 ，严重了其在临床领域的进一步应用。３， ４，６，７，１２，１２ｂ－六氢吡嗪［１’，２’：１，２］吡啶并Ｊ ３， 药提供一个新的研究方向。 ＨＮ ０ ａ Ｆａｓｃａｐｌｙｓｉｎ 图１ ＰＩ与Ｆ的化学结构图 １材料与方法 ｉ．１ 试剂与仪器 由中国典型培养物保藏中心获得（中国武汉）。ＲＰ． ＭＩ １６４０培养基，１００ Ｕ／ｍＬ青霉素，链霉素，四甲基 偶氮唑盐（ＭｑＴ，购自Ｓｅｒｖａ公司），ＭＥＭ培养液，胰 蛋白酶，新生牛血清，０．４％台盼蓝染液，新生小牛血 人肝癌细胞（Ｂｅ１．７４０２）、人宫颈癌细胞（Ｈｅｌａ）、 人乳腺癌细胞（Ｔ４７Ｄ）和小鼠红白血病细胞（ＭＥＬ）， 收稿日期：２０１３一ｌ２一Ｏ３ 作者简介：白璧辉（１９９２一），男，中医学（骨伤科学方向）２０１１级本科在读。 第３１卷第４期 ２０１４年８月 甘肃中医学院学报 Ｊ．ＧＡＮＳＵ ＣＯＬＩ ＥＧＥ ＯＦ ＴＣＭ Ｖ０１．３１ Ｎｏ．４ Ａｕｇ．２０１４ 清购自灏洋公司（天津）。阳性对照药Ｆ，化合物ＰＩ （由兰州科恒化玻有限公司合成）；Ｈｏｅｃｈｓｔ染色剂， 购自上海麦约尔生物技术有限公司。 ＣＯ，培养箱，德国Ｈｅｒａｅｕｓ公司，型号ＢＢ１５；超 用ＰＢＳ冲２～３遍后，每孑Ｌ加入２００ Ｉ 新鲜配制的 含０．２ ｍｇ／ｍＬ ＭＴｒ的无血清培养基。３７℃继续培 养４ ｈ。正常情况下看到黄色的溶液变成深蓝色，以 １ ０００ ｒ／ｒａｉｎ离心１０ ｒａｉｎ，小心弃去上清液，并加入 ２００ Ｌ ＤＭＳＯ，置摇床上低速振荡１０ ｒａｉｎ混匀后， 净工作台，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司，型 号ＢＣＮ一１３６０；自动立式压力蒸气灭菌器，上海申安 医疗器械厂，型号４０Ｂ１；倒置显微镜，南京江南光电 有限公司产品，型号ＸＤ－１０１；光学显微镜，Ｏｌｙｍｐｕｓ 在酶标仪上以５７０ ｎｍ试验波长、４５０ ｎｍ参比波长 测定光密度值 １－６１。 通过ＭＴＴ法测定细胞抑制率和细胞存活率。 ＣＫＸ４１，日本；酶联免疫检测仪，Ｂｉｏ—ＲＡＤ公司，型 号５５０；离心机，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ中国有限公司，型号 ５８０４Ｒ；血细胞计数板，上海求精生化试剂仪器有限 公司；微量振荡器，金坛市富华仪器有限公司，型号 ｚｗ—Ａ；移液、移液管、离心管和９６孑Ｌ板等。 １．２样品制备 分别称取阳性对照药Ｆ和化合物ＰＩ，溶解到 ２．５ ｍＬ二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）中，加入２．５ ｍＬ乙醇， 配成０．０１ ｍｍｏｌ／ｍＬ（是终浓度的１００倍，终浓度为 １０～ｍｍｏｌ／ｍＬ，乙醇终体积分数为０．５％），取１ ｍＬ 配置下一浓度溶液，加入９ ｍＬ（ＤＭＳＯ：乙醇＝１： １）溶液稀释，依据预实验确定１０～，１０～，１０一，１０ 及１ ０ ｍｍｏｌ／ｍＬ为最终实验浓度。 １．３细胞培养 选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用胰酶消化后 （悬浮细胞无需胰酶消化），用含１０％小牛血清的 ＲＰＭＩ １６４０培养基配成２ｘ１０ 个／ｍＬ的细胞悬液，接 种在９６孔培养板中，每孑Ｌ接种２００ Ｌ（对照组只加培 养基２００ Ｌ，不加细胞），在３７℃、１００％相对湿度、 ５％ＣＯ，、９５％空气的培养箱中预培养２４ ｈ 。 １．４ 药物干预 实验组换新的含不同浓度被测样品的培养基，对 照组则换含等体积溶剂的培养基，每组设３个平行 孔，加入不同浓度目标物１００ ，３７℃、１００％相对湿 度、５％ＣＯ，、９５％空气的培养箱孵育２４，４８，７２ ｈ 一。 １．５细胞计数 贴壁细胞用０．２５％胰酶消化后（悬浮细胞无需 胰酶消化），悬浮于含５％胎牛血清的ＭＥＭ培养液 中，用玻璃管轻轻吹打成单细胞悬液。取少量细胞悬 液加等量的０．４％台盼蓝染液，显微镜下用血细胞计 数板计数活细胞（台盼蓝不着色的为活细胞），根据计 数细胞浓度调成需要浓度（２ｘ１０ 个／ｍＬ） 。 １．６ ＭＴＴ法检测细胞增殖抑制率 对于贴壁肿瘤细胞，直接弃去上清液；对于悬浮 细胞，以１ ０００ ｒ／ｒａｉｎ离心１０ ｒａｉｎ，小心吸掉上清液； １２一 公式如下： 抑制率／％＝（对照空白平均ＯＤ值一化合物孔 平均ＯＤ值）／对照空白平均ＯＤ值 细胞存活率／％：化合物孑Ｌ平均ＯＤ值／对照空 白平均ＯＤ值 １．７细胞形态学变化观察 用３．５￣ｍｏｌ／Ｌ的Ｐ１分别处理Ｈｅｌａ细胞．时间 分别为１２，２４，３６ ｈ；用溶剂处理的细胞组作为又寸 照组；用相差显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＣＫＸ４１）分别观测 ３．５￣ｍｏｌ／Ｌ的ＰＩ处理Ｈｅｌａ细胞随时问变化的 结果。 １．８ Ｈｏｅｃｈｓｔ染色法检测细胞凋亡 进行Ｈｏｅｃｈｓｔ染色，取对数生长期的Ｈｅｌａ细胞， 以３×１０’个／ｍＬ浓度接种于６孑Ｌ板中，１孔放入１ 片无菌盖玻片，培养２４ ｈ细胞爬片后，分别加入 ＧＬＰ（终质量浓度为２．５ ｍｇ／ｍＬ）和５一ＦＵ（终质量浓 度为２５ ｇ／ｍＬ），对照组不加样品，设２组重复。继 续培养４８ ｈ后，吸尽培养液，ＰＢＳ洗涤２次，加入 ０．５ ｍＬ固定液（甲醇与冰乙醇体积比为３：１），固 定１０ ｒａｉｎ后，去固定液，ＰＢＳ洗涤２遍，用Ｈｏｅｃｈｓｔ 染色（５ ｇ／ｍＬ），置于荧光显微镜下观察、拍 昭［ 一 一 ２结果 ２．１细胞毒活性 计算不同浓度条件下ＰＩ和Ｆ对４种癌细胞的 生长抑制率，通过回归计算求得Ｉｃ 结果见表１。 从表１数据可以发现，ＰＩ对Ｂｅｌ一７４０２，Ｈｅｌａ， Ｔ４７Ｄ，ＭＥＬ具有和Ｆ相似的抗肿瘤活性，尤其对 Ｈｅｌａ的抑制活性较强，ＩＣ∞＝（２．４±０．４）￣ｍｏｌ／Ｌ。 因此，在进行下一步生物活性实验中选用贴壁细胞 Ｈｅｌａ作为实验细胞。 ２．２对Ｈｅｌａ细胞的增殖抑制作用 在Ｈｅｌａ细胞中分别加入Ｉｃ 。为０，０．２５，０．７５， １．００和１．５０倍的ＰＩ和Ｆ培养２４ ｈ，计算不同浓度 条件下的细胞存活率，结果见表２。
