理生理杂志Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｐｈｙｈ ｓｉｏｌｏ 丝ｉ！ ２； ！ 二 ！ ・２１９５・ ［文章编号］１０００－４７１８（２００８）１１—２１９５—０５ ｓｉＲＮＡ靶向ＭＩＦ重组逆转录病毒载体构建及 稳定表达细胞株的筛选水 戴波 ， 肖定璋 ，余细勇 （ 广东省人民医院医学研究中心，广东广州５１００８０； 南方医科大学，广东广州５１０５１５） ［摘要］ 目的：构建并鉴定巨噬细胞移动抑制因子（ＭＩＦ）特异性ｓｉＲＮＡ重组逆转录病毒载体，将其导入 ＰＨＯＥＮＩＸ细胞中，筛选出分泌ＭＩＦ—ｓｉＲＮＡ病毒的包装细胞，其分泌的病毒可以抑制ＭＩＦ蛋白的表达，并初步了解 稳定沉默ＭＩＦ细胞株的特性。方法：体外合成含针对ＭＩＦ特异基因序列的寡核苷酸并定向克隆入ｐＳｕｐｅｒ．ｒｅｔｒｏ逆 转录病毒载体，构建的载体通过酶切、测序鉴定后，采用脂质体介导转染包装病毒细胞株ＰＨＯＥＮＩＸ，收获病毒上 清；将其感染ＨｅＬａ细胞株，经过嘌呤霉素筛选得到抑制Ｍ１Ｆ表达的ＨｅＬａ细胞株。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定ＭＩＦ表达 的抑制效果并通过迁移实验、软琼脂糖克隆形成实验比较ＨｅＬａ—ｐＳｕｐｅｒ—ＭＩＦ和ＨｅＬａ—ｐＳｕｐｅｒ—ｍｏｃｋ之间的特 性。结果：构建了重组逆转录病毒载体ｐＳｕｐｅｒ—ＭＩＦ，转染包装病毒细胞株ＰＨＯＥＮＩＸ，病毒上清感染ＨｅＬａ细胞，抑 制了ＨｅＬａ细胞内源性ＭＩＦ蛋白的表达。沉默ＭＩＦ蛋白后导致ＨｅＬａ细胞迁移能力下降，不依赖支持物生长的特 性减弱和黏附能力下降，同时稳定表达沉默ＭＩＦ蛋白的细胞株生长周期停留在Ｇｏ／Ｇ。期与对照组相比凋亡减少。 结论：构建了重组逆转录病毒载体ｐＳｕｐｅｒ—ＭＩＦ，转染包装细胞所产生的病毒上清，能够抑制ＨｅＬａ细胞内的ＭＩＦ 蛋白表达，表明ＭＩＦ对ＨｅＬａ细胞的迁移和不依赖支持物生长能力有重要作用。 ［关键词］ 巨噬细胞移动抑制因子；ＲＮＡ干扰；逆转录病毒载体 ［中图分类号］Ｑ７８ ［文献标识码］Ａ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉ０ｎ ０ｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（Ｍ珂）ａｎｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ・ ｍｅｎｔ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ＨｅＬａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ａ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ０ｆ ＭＩＦ ＤＡＩ Ｂｏ ，ＸＩＡ０ Ｄｉｎｇ—ｚｈａｎｇ ，ＹＵ Ｘｉ—ｙｏｎｇ （ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｎａｎｇｚｈｏｕ ５１００８０，Ｃｈｉｎａ； Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０５１５，Ｃｈｉａ．Ｅ—ｍａｉｎｌ：ｄｚｈｘｉａｏ＠１６３．ｃｏｎ） 『ＡＢＳＴＲＡＣＴ １ ＡＩＭ：Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡ）ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ＭＩＦ）ａｎｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｓｔａｂｌｅ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｏｆ ＭＩＦ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｏｆ ｍａｍｍａｌＪａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．ＭＥＴＨ０ＤＳ：Ｗｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｏｌｉｇｏ—ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ＭＩＦ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｔｈｅｍ ｉｎｔｏ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｐＳｕｐｅｒ．ｒｅｔｒｏ．Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｃｏｎ— ｓｔｎｃｔｒｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｔｈｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ＲＮＡｉ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｅｔｅｄ ｉｎｔｏ ｐａｃｋｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＰＨＯＥＮＩＸ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｓｅｒｅｃｔｅｄ ｂｙ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ｌａｔｅｒ．ＨｅＬａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｗａｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ＰＨＯＥＮＩＸ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔａｂｌｅ ＨｅＬａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｓｈｏｗｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｔｏ ｓｉｌｅｎｃｅ ＭＩＦ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｐｕｍｍｙｃｉｎ．Ｗｅ ａｌｓｏ ｃｏｍｐａｒｅ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ ｏｆ ＨｅＬａ—ｐＳｕｐｅｒ—ｍｏｃｋ ｔｏ ＨｅＬａ—ｐＳｕｐｅｒ—ＭＩＦ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ，ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｓｓａｙ，ｓｏｆｔ ａｇａｒ ａｓｓａｙ ａｎｄ ＦＡＣＳ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ—ｃｙｃｌｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．ＲＥＳＵＬＴＳ：Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．Ｔｈｅ ＨｅＬａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｏｆ ｐａｃｋａｇｅ ＰＨＯＥＮＩＸ ｃｅｌｌｓ ｗｆｌｔ￣ｐｅｒ－ ｓｉｓｔｅｎｔ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｏｆ ＭＩＦ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｏｆ ＭＩＦ ｉｎ ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｄ． ｈｅｓｉｏｎ，ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｃｌｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＦＡＣＳ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｏｆ ＭＩＦ ａｒｒｅｓｔｅｄ ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｇｎ／Ｇｌ ｐｈａｓｅ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ：Ｗｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｓｔａｂｌｅ ＨｅＬａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ａ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｏｆ ＭＩＦ．Ｏｕｒ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｕｄｉｅｓ ｒｅｖｅａｌ ｔｈａｔ ＭＩＦ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ＨｅＬａ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｃｈｏｒａｇｅ—ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｒｏｗｔｈ． ［ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ］ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｒｏｔｇｉｏｎ—ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒｓ；ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ 巨噬细胞移动抑制因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ 理条件下加剧炎症进程。ＭＩＦ在内毒素休克、结肠 ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ，ＭＩＦ）是一种多效的促炎因子，在病 炎、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、胰腺炎等急慢 ［收稿日期］２００８一Ｏ２一Ｏ１ ［修回日期］２００８—０７—０７ ［基金项目］国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３０７７２１４２）；广东省自然科学基金资助项目（Ｎｏ．０６０２０８９７） △通讯作者Ｅ—ｍａｉｌ：ｄｚｈｘｉａｏ＠１６３．ｃｏｎ 性炎症中具有重要作用。随后发现，ＭＩＦ在肿瘤的 测序鉴定。 发生、发展及转移等方面也起着重要作用。由于 ２．４ 重组质粒转染包装病毒细胞株 将包装病毒 ＭＩＦ蛋白功能的复杂性与多样性，迄今它与多种细 细胞ＰＨＯＥＮＩＸ接种到６孔板中，每孔１×１０ ，完全 胞因子的交互作用的内在机制仍不完全清楚ｌ】ｌ２ｊ，因 培养基培养１２ ｈ后更换ＤＭＥＭ培养１ ｈ，分别使用 此，有必要深入研究ＭＩＦ蛋白的功能。本研究利用 ｐＳｕｐｅｒ—ｍｏｃｋ（空载体Ｓｕｐｅｒ．ｒｅｔｒｏ）、ｐＳｕｐｅｒ—ＭＩＦ１、 ＲＮＡｉ技术，选择ＭＩＦ为靶点，采用含ｓｉＲＮＡ的重组 ｐＳｕｐｅｒ～ＭＩＦ２质粒各４ ｇ，脂质体Ｌｉｐｏ— 逆转录病毒感染靶细胞，高效、特异地抑制ＭＩＦ表达 ｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ １０ ｉｘＬ／ｗｅｌｌ孔转染ＰＨＯＥＮＩＸ。转染 的作用，为研究ＭＩＦ的功能提供了实验基础。 材料和方法 １材料 １．１主要试剂 逆转录病毒载体Ｓｕｐｅｒ．ｒｅｔｒｏ购自 ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ并由本室改造，限制性内切酶Ｂｇｌ １Ｉ、 ＥｃｏＲ Ｉ、肌 ｌｌＩ、Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自ＴａＫａＲａ；大肠杆 菌菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ｏｔ由本实验室保存；脂质体Ｌｉｐｏ． ｆｅｃｔｍｉｎｅ２０００购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；小剂量质粒提取试剂盒 购自Ｔｉａｎｇｅｎ；质粒纯化试剂盒购自Ｑｉａｇｅｎ；上、下游 引物由上海博尚生物有限公司合成。ＭＩＦ兔抗人抗 体购自Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，培养皿、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ购自Ｃｏｍｉｎｇ，低 熔点琼脂糖购自ＴａＫａＲａ，ｃｙｔｏｍａｔｒｉｘ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｎｓｉｏｎ ｓｔｒｉｐｓ购自Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（产品号ＥＣＭ１０４）。 １．２细胞株ＨｅＬａ细胞株由本研究室保存；包装 病毒细胞株ＰＨＯＥＮＩＸ购自Ｏｒｂｉｇｅｎ；细胞培养基 ＤＭＥＭ、新生小牛血清、特级胎牛血清均购自Ｇｉｂｃｏ。 培养液均含有１００ ｍｇ／Ｌ氨苄青霉素，３７℃、５％ＣＯ： 饱和湿度下培养。嘌呤霉素购自Ｓｉｇｍａ，用生理盐水 配成ｌ０ Ｌ，一２０℃保存备用。聚凝胺（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ） 购自Ｓｉｍｇａ，生理盐水配成４ Ｌ，４℃保存备用。 ２方法 ２．１ ｐＳｕｐｅｒ．ｒｅｔｒｏＲＮＡｉ的设计及合成 根据Ｇｅｎ－ Ｂａｎｋ提供的ＭＩＦ基因ｃＤＮＡ序列（编号ＧＩ： １８６９９５６８），通过ｗｗｗ．ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ．ｃｏｍ网站提供的 工具软件设计，所选择ＭＩＦ的靶点序列分别为：ｐＳｕ－ ｐｅｒ—ＭＩＦ—Ｆ１ ５’一Ｃ Ｉ＇ＡＴｒＡＣＧＡＣＡＴＧＡＡＣＧＣＧ一３’： ｐＳｕｐｅｒ—ＭＩＦ—Ｆ２ ５’一ＣＡＡＣ ｒ℃ＣＡＣＣｒ兀℃ＣＣＣＴＡ Ａ一３’。 合成的正、反义链经过变性、复性后形成双链 ＭＩＦ基因ｓｉＲＮＡ，类似发卡样两端配对寡核苷酸链， 其中含９个碱基的圈连接起来，分别在５’和３’端产 生 １１与ＨｉｎｄｌｌＩ酶切位点，与载体连接后 １１Ｉ酶 切位点消失，据此筛选所构建的重组载体。 ２．２逆转录病毒载体的构建将合成的正、反义链 经过变性、复性后形成双链ＭＩＦ基因ｓｉＲＮＡ，采用双 链定向亚克隆入逆转录病毒载体Ｓｕｐｅｒ．ｒｅｔｒｏ，转化大 肠杆菌菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ｃｔ，氨苄青霉素（１００ ｍｇ／Ｌ）筛 选出阳性克隆，提取质粒。 ２．３ 重组质粒ＭＩＦｓｉＲＮＡ的鉴定 重组质粒用 ＥｃｏＲ Ｉ与ＨｉｎｄｌｌＩ酶进行双酶切，酶切产物行１％琼 脂糖凝胶电泳。阳性克隆分别命名为ｐＳｕｐｅｒ— ＭＩＦ１、ｐＳｕｐｅｒ—ＭＩＦ２，纯化后送到上海博尚生物公司 ｌ２ ｈ后更换完全培养基，４８ ｈ后加入１ ｍｇ／Ｌ嘌呤霉 素，筛选３—４周获得阳性克隆。细胞株命名为 ＰＨＯＥＮＩＸ—ｐＳｕｐｅｒ—ｍｏｃｋ、ＰＨＯＥＮＩＸ—ｐＳｕｐｅｒ— ＭＩＦ１ ｓｉＲＮＡ、ＰＨＯＥＮＩＸ—ｐＳｕｐｅｒ—ＭＩＦ２ ｓｉＲＮＡ。 ２．５ 重组逆转录病毒感染ＨｅＬａ细胞株将筛选获 得的ＰＨＯＥＮＩＸ阳性克隆培养至９０％融合后换成无 嘌呤霉素的完全培养基，２４ ｈ后收集细胞上清，滤液 一７Ｏ℃保存。ＨｅＬａ细胞株接种到６孔板中，加入 １ ｍＬ ＰＨＯＥＮＩＸ细胞上清滤液并加入２ ｍｇ／Ｌ聚凝 胺，３７℃、５％ＣＯ 条件下培养，重复感染２次，继续 培养２４ ｈ，更换含１ ｍｇ／Ｌ嘌呤霉素的完全培养基筛 选培养，每３—４ ｄ换液，约２０ ｄ后筛选完成。细胞 扩增、传代，所产生的细胞株分别命名为ＨｅＬａ—ｐＳｕ・ ｐｅｒ—ｍｏｃｋ、ＨｅＬａ—ｐＳｕｐｅｒ—ＭＩＦ１ ｓｉＲＮＡ、ＨｅＬａ—ｐＳｕ・ ｐｅｒ—ＭＩＦ２ ｓｉＲＮＡ。 ２．６ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测ＭＩＦ蛋白的沉默将筛选 后的ＨｅＬａ细胞株接种到６孔板中，培养至每孑Ｌ １× ｌ０ 时，收集细胞。用适量细胞裂解液（１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ—ＨＣ１，０．２％叠氮钠，０．１％ＳＤＳ，１００ ｍｇ／Ｌ ＰＭＳＦ，１ ｍｇ／Ｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，１％ＮＰ４０，０．５％去氧胆酸 钠，１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ１）裂解，ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂 盒检测蛋白浓度，上样５０ ｇ总蛋白，１０％ＳＤＳ聚丙 烯酰胺凝胶电泳，将蛋白质转移到ＰＶＤＦ膜，用含 ５％脱脂奶粉的ＴｒＢＳ（Ｏ．１ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ—ＨＣ１，ｐＨ ７．５； ０．２％ＮａＣ１；０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）３７℃封闭１—２ ｈ，分别加 入兔抗人ＭＩＦ单克隆抗体（Ｉ：２ ０００稀释，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ），或小鼠抗人ＧＡＰＤＨ单克隆抗体（１：１ ０００稀 释）４℃孵育过夜。ＴＹＢＳ漂洗５ ｍｉｎ×３次；兔抗辣 根过氧化物酶标记Ⅱ抗（１：５ ０００稀释）３７℃孵育１ ｈ；ＴＹＢＳ漂洗５ ｍｉｎ ｘ ３次；ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔｅ Ｆｅｍｔｏ （Ｐｉｅｒｃｅ）敏感曝光试剂盒曝光底片显影。 ２．７ 细胞迁移实验操作按Ｃｏｍｉｎｇ公司Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ 说明书进行。在Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ下室的ＤＭＥＭ培养液中 加入１０％血清，在Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上室分别滴加１×１０ ＨｅＬａ—ｐＳｕｐｅｒ—ｍｏｃｋ、ＨｅＬａ—ｐＳｕｐｅｒ—ＭＩＦ１ ｓｉＲＮＡ 细胞悬液。将上室置于下室之中，在３７℃温箱孵 育。１６ ｈ后取出上室，用棉签将残留在上室内表面 上的细胞拭去。上室经ＰＢＳ洗涤后，用４％多聚甲醛 固定迁移至上室外表面上的细胞，细胞用含０．１％龙 胆紫的２０％乙醇染色２０ ｒａｉｎ，用清水洗３遍，显微镜 下（２００×）计算迁移细胞数，结果取５个视野细胞 计数的平均值。 2．8软琼脂糖克隆形成实验，用PBSX配06％．和12％．的低熔点琼脂糖灭菌待用；2．．DMEM细胞培溶化06％和12％的琼脂糖(57℃水浴溶化)42qC恒温备用取3mL12％的琼脂糖与等体积的2×细胞培养液混匀铺在60mm细胞培养皿养液。，，．，中凝固后备用，—。消化sHeLa—pSup，er—mock、HeLapSupe．r—MIFliRNA细胞各取5X10。细胞用，15mL2×细胞培养液混匀重悬成单细胞悬液然后0．琼脂糖混合铺在上述的已凝固的06％琼脂糖培养皿内每隔3d补充23滴新鲜的培养液培养15d后克隆形成使用0005％龙胆与等体积的．6％，—。，，．紫染色2．1h后显微镜下(40，×)观察克隆个数on。9lla细胞黏附性实验dhens按照Chemic。公司cytom200atreixceionstrips说明书进行—室温—~L／w、llFig1Ideconntificationofrecomrbin—antretrovaniralvecrtor—sincludingvPBS—洗涤2遍胰酶消化HeLapSupermockHeLaMIFsiRNA细胞制成单细胞悬液计数pSuper，—trolvetor，pSupeMIFlsdMpSupe：marMIF2l．ia—EcoRItroandHindIIIdige：ption．ker—r；Line：con，，，调整细胞浓度为JI]人孔每fLT1×10。l；Line2RISuper—MIFI；Line3：pSupeMIF2cells／L。每组分别设37℃3，3个复后取图1Eco与HindllI“酶切鉴定重组质粒!，100ILL，细胞悬液洗涤10％100，孵育5ar1h!揣出96孔培养板用胞m。PBS2遍去除未黏附细in，1』^。●J0。…。‘1：ii：荸营蔓署j￡Ⅻw………’“。。∞…∞曼童I蕊曼：c●■H一…c‘’：黔一2：慧!：j2j嚣’”々篇翟臀翟：：霉”，，含3—02％．龙胆紫的乙醇染色tx用PBS0．洗涤o5遍每fL~H入，．L等体积混匀的1I^一一il．kⅫo^^^^．．^～…也p’．，．th^Ⅳj五^_。：j。l／LNaH：PO。(pH4。5)和nm50％乙醇以去除残余染r—’色2—酶标仪在波长r—570读数—。。i．忱j”』L此。．、．，、‘．．^，．埘一．．．^^!^^…．．1：．．10流式细胞仪检测HeLaMIFr—pSupemock、HeLaFig2SequencingfpSuper—M1FI．pSupe—siRNA细moc胞的细胞周期和凋亡—将iRNA1，图2pSuper—MIFl‘测序结果?东：HeLapSupek、HeLapSuper—MIFlEDTAs…．．．…细胞分别用，025％．胰蛋白酶和，0．02％(：1)。：二0癸：舞：：’“’’“‘。，，：j：：曼j囊“jj：…。：：：等茹0：=。_●‘叫‘=：0之：1．：：=嚣消化细胞制备单个细胞悬液洗涤再用，70％、冷乙醇固定．PBS1％，TritonX一100001％。RNase和．．^．。“一f㈠㈧J-^I^&^“fj^i一，≯!005％PI．处理通过，300488目尼龙网备检lqm用Profile1I。■帆船jjenc。．，|．_：．“—、。。』卜‰j型流式细胞仪在DNA，激发波长下测定细胞。用Muhicycle软件分析细胞周期分布情况Annex细Fig3SequpSuingofpSuper—MIF2．胞早期凋亡数目通过(BDBioEminVPIx=检测试剂盒488lqm图32perrnn—MIF2测序结果sc=iences)检测。。激发波长nexE；发射Westeblotting检测检测MIFlMⅡ蛋MIF、白的沉默。波长过3FL3530nmAninV—FITC的绿色荧光通pSupeWesterblotingtpSuper—蛋白结果见图4—重组FITC通道(FLl)检测。；PI红色荧光通过PI通道逆转录病毒r—pSuperMIF2MIF检测mock相比均可以有效沉默a与空白对照蛋白的表达。统计学处理两组数据比较采用t3沉默MIF后HeL细胞迁移活性下降，—检验数据用均数，4标准差(元±s)表示。结1果小牛血清趋化作用下迁移至下室的细胞数目对照组pSupermock为(892±211)cells／M1F组为(592±136)cells／视野pSuper视野10％．．—在，．．。两组比较有显著差异(P4<0．05)见图，5。酶切鉴定重组质粒逆转录病毒载体pSuper．沉默MIF后HeLa细胞不依赖支持物生长的特pSuperetro由本室改造：成功，性减弱通过软琼脂克隆形成实验对照组，构建后重组质粒％fⅢ酶切位点应该消失阳性克隆经EcoRI与HindIlI酶切后可产生280bp大小的片段阴性克隆经EcoRI与Hindm酶切后则产生230。r—mock和pSupe．r—MIFl在培养、15d．后克隆数目分别-4为(14野，bp680bp两条带。、本实验中重组质粒经EcoRI与)cells／视野(3两组比较有显著差异(P<00044．0680175．)cells／视。．05)见图6，21982HeLa。。pSuper—。mockHeLapSuperMIF36kDGAPDH17kDMIFFig4WesterermblottingusanalyzedthepSuper～effectofknockdowanrnMIFby20，．thetrovir：vectorsrMIFI：dpSuperMIF2s．16LinLinelpSupe—mocks；Line2．pSupeMIFliRNA；凸一e3：pSuper—MIF2iRNA衰pSu12图4Westernblotting—检测逆转录病毒载体对COSk一per—MIFl苫084和pSuperHcLaMIF27细胞株MIF的抑制效果。JrpSupcrmocHe[a—pSupcrMIFFig6120臣100≥兰0‘图67一n6。：一。。口。石。L{时II。飞一口u4806040nO5c；0302O●0暑兰20【】Hel，apSuperr——mockHeLa—pS—uperMIF——Fig5HeLawereapSupetorsmocukeranccedHeLahambellsintheS．pSupertransweuMIFccells．ddednthepprofllhamberrsSixteehoudbylaterswa，the，theppero。chambewereremovebbingcounandbon：ttomf
