Taq+DNA聚合酶的改造及应用

Taq DNA聚合酶的改造及应用

姓名：林晴申请学位级别：硕士专业：医学细胞生物学指导教师：李庆阁

20070801

厦门大学学位论文原创性声明兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下完成的研究成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。坤ｙ月１日声明人（签名）：峤请厦门大学学位论文著作权使用声明本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。本学位论文属于１、保密（），在年解密后适用本授权书。２、不保密（＼／（请在以上相应括号内打“√＂）作者签名：牺导师签名：多暨∥闽日期：跏■譬月ｆＥｔ日期：∽ｑ年ｙ月ｚ．Ｅｔ摘要摘要本论文对ＴａｑＤＮＡ聚合酶展开了研究，从ＴａｑＤＮＡ聚合酶表达载体出发，对其进行定向改造，分别用于探针检测ＰＣＲ体系和焦磷酸水解激活的聚合酶反应（ＰＡＰ）技术，最后制备其抗体达到热启动ＰＣＲ的目的。第一章，概述了ＴａｑＤＮＡ聚合酶在ＰＣＲ中的应用，普通ＴａｑＤＮＡ聚合酶虽然得到广泛使用，但是仍然存在不足。各个实验室针对ＴａｑＤＮＡ聚合酶的不足进行了不同形式的改造，以降低或消除酶的５’一３’核酸外切酶活性，提高酶的续进性、忠实性、特异性和耐热性等。第二章，我们也通过定点突变和缺失突变的方法在基因水平对ＴａｑＤＮＡ聚合酶进行改造，以消除酶的５’一３’核酸外切酶活性和降低ＴａｑＤＮＡ聚合酶对ｄｄＮＴＰ的抵抗，并对改造后的酶蛋白进行表达纯化。第三章，将改造的酶进行了各方面的应用。第一，应用于探针检测实时ＰＣＲ体系。在各种基于探针检测的实时ＰＣＲ体系中，使用普通的ＴａｑＤＮＡ聚合酶，有时看不到Ｓ型信号升起，在ＰＣＲ循环的开始，探针的荧光信号本底就很高。我们将改造后的酶应用于探针检测，发现可以很好地解决这一问题，同时也进一步验证了初始荧光信号本底高是由于探针的荧光基团被具有５’＿３’核酸外切酶活性的ＴａｑＤＮＡ聚合酶酶切造成。第二，应用于ＰＡＰ技术。ＰＡＰ技术即焦磷酸水解激活的聚合酶反应技术。在ＰＡＰ反应体系中，应用普通的ＴａｑＤＮＡ聚合酶无法进行突变的检测，我们改造后的Ｔａｑ—ＦＳＤＮＡ聚合酶，可以成功地解决这一问题，进行稀有突变的检测，可以区分单碱基的差异。第三，酶抗体应用实现热启动ＰＣＲ。在ＰＣＲ反应中，由于ＴａｑＤＮＡ聚合酶在低温下也具有活性，在ＰＣＲ反应开始之前容易产生非特异性的扩增以及产生引物二聚体，为了解决这个问题，我们制备了酶的抗体，在低温下形成抗原抗体复合物使酶失去活性，只有在较高的温度下酶才得以释放发挥活性。极大的提高了ＰＣＲ反应的特异性和灵敏度。关键词：ＴａｑＤＮＡ聚合酶；实时ＰＣＲ：ＰＡＰ：热启动ＰＣＲａｂｓｔｒａｃｔＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｉｓｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｃｏｎｓｉｓｔｓｏｆｔｈｒｅｅｐａｒｔｓ．ＩｔｆｏｃｕｓｅｓｏｆＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．ＳｔａｒｔｉｎｇｆｒｏｍｏｎｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｃｏｍｐｌｅｔｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｗｅｍａｄｅａｖａｒｉｅｔｙｏｆｍｏｄｉｆｉｅｄＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓａｎｄａｐｐｌｉｅｄｔｈｅｍｔｏｒｅａｌ—ｔｉｍｅＰＣＲ，ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｌｙｓｉｓ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ（ＰＡＰ）ａｎｄｈｏｔ—ｓｔａｒｔＰＣＲ．Ｉｎｃｈａｐｔｅｒ１，ｗｅｒｅｖｉｅｗｅｄｔｈｅｗｉｄｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｉｎＰＣＲ．ＢｅｃａｕｓｅｎａｔｕｒａｌＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｈａｓｓｏｍｅｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓｈａｄｍｏｄｉｆｉｅｓＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｔｏａｃｈｉｅｖｅｈｉｇｈｅｒａｎｄｔｈｕｓｍａｎｙｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｆｉｄｅｌｉｔｙ，ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ，ａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ａｌｓｏ，ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＷａｓｍｏｄｉｆｉｅｄｔｏａｃｈｉｅｖｅｈｏｔ—ｓｔａｒｔＰＣＲｂｙｕｓｉｎｇｐｈｙｓｉｃａｌ，ｃｈｅｍｉｃａｌａｓｗｅｌｌＩｎａｓａｎｔｉｂｏｄｙｍｅｔｈｏｄｓ．ｏｒｃｈａｐｔｅｒ２，ｗｅｆｉｒｓｔｒｅｄｕｃｅｄｄｅｌｅｔｅｄｔｈｅ５＇－ｎｕｃｌｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｂｙｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇＧ４６Ｄｍｕｔａｔｉｏｎａｎｄｂｙｄｅｌｅｔｉｎｇｔｈｅ５＇－ｎｕｃｌｅａｓｅａｌｓｏｐｒｅｐａｒｅｄｄｏｍａｉｎ．ＷｅａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄＴａｑ－ＦＳＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｔｈａｔｈａｓｎｏｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｙｐｅｏｆｄＮＴＰｓ．Ｉｎｃｈａｐｔｅｒ３，ｗｅａｐｐｌｉｅｄｔｈｅｍｏｄｉｆｉｅｄＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｉｎｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｒｅａｓ．Ｆｉｒｓｔｌｙ，ｗｅｕｓｅｄｍｕｔａｔｅｄＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｉｎｄｉｓｐｌａｃｉｎｇｐｒｏｂｅ－ｂａｓｅｄｒｅａｌ－ｔｉｍｅａｖｏｉｄｔｈｅｆａｌｓｅｓｉｇｎａｌＰＣＲ．ＷｅｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｍｏｄｉｆｉｅｄＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｏｕｌｄｃａｕｓｅｄｂｙ５’ｔｏ３’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｓｅｃｏｎｄｌｙ，ｗｅＴａｑ—ＦＳｉｎＰＡＰｔｈａｔｃｏｕｌｄｇｒｅａｔｌｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｉｒｄｌｙ，ｗｅｕｓｅｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＰＡＰｆｏｒｒａｒｅｍｕｔａｔｉｏｎｔｏｕｓｅｄｐｒｅｐａｒｅｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｃｈｉｅｖｅｈｏｔ—ｓｔａｒｔＰＣＲ．ＲａｂｂｉｔａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｏｆＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｔｌｏｗｔｅｍｐｒｅｔｕｒｅ．Ｂｙｈｅａｔｉｎｇａｔｈｉｇｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙＷａｓｄｅｎａｔｕｒａｌｉｓｅｄＴｈｅｒｅｓｕｌｔａｎｄｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＷａｓｒｅｃｏｖｅｒｅｄ．ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｍｕｃｈｈｉｇｈｅｒｓｅｎｃｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｐｅｃｉａｌｉｔｙｗｅｒｅａｃｈｉｅｖｅｄｕｓｉｎｇｓｕｃｈｈｏｔ．ｓｔａｒｔＰＣＲ．Ｋｅｙｗｏｒｄ：ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；Ｒｅａｌ··ｔｉｍｅＰＣＲ；ＰＡＰ；Ｈｏｔ·－ｓｔａｒｔＰＣＲ３第一章ＴａｑＤＮＡ聚合酶研究进展第一章ＴａｑＤＮＡ聚合酶研究进展１９８３年美国ＰＥ—Ｃｅｔｕｓ公司的Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ发明了聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，简称ＰＣＲ）技术，在体外几个小时就可以将一个ＤＮＡ分子扩增１０９倍ｎ。３１。ＰＣＲ技术具有特异性强、灵敏度高、快速、简便及重复性好等特点Ｈ３。该技术的问世，是分子生物学方法学上的一次，大大促进了生命科学及相关学科的发展。Ｍｕｌｌｉｓ因此荣获１９９３年度诺贝尔奖。ＰＣＲ技术基本原理是根据ＤＮＡ双螺旋模型所建立的体细胞复制的机制，以及双链ＤＮＡ在体外复制的特点设计的。以ＤＮＡ为模板，以小片段的ＤＮＡ为引物，在ＤＮＡ聚合酶的催化下将ｄＮＴＰｓ合成为ＤＮＡ新链。因此ＤＮＡ聚合酶是实现ＤＮＡ复制的关键。Ｋｌｅｎｏｗ片段就是最早应用于ＰＣＲ的ＤＮＡ聚合酶。但由于ＫｌｅｎｏｗＤＮＡ聚合酶在６０＂Ｃ高温下很快就失活，故每一轮ＰＣＲ都要追加Ｋ］ｅｎｏｗＤＮＡ聚合酶，而且，Ｋｌｅｎｏｗ酶反应温度偏低，容易形成引物与ＤＮＡ模板的非特异性扩增，而且反应易受到某些ＤＮＡ二级结构的影响而得不到完整的扩增产物。ＫｌｅｎｏｗＤＮＡ聚合酶的这些缺点使得ＰＣＲ过程烦琐、复杂而且昂贵，了ＰＣＲ技术的推广与应用。此后，人们曾使用Ｔ４ＤＮＡ聚合酶和Ｔ７聚合酶，两者虽然使得扩增的特异性增加和ＤＮＡ合成速度提高，但始终因热稳定性差而得不到广泛应用晦１。１９６９年在美国黄石国家森林公园火山温泉中分离得到一种水生栖热菌（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＹＴ—ｌ，它生长在７０。Ｃ－７５６Ｃ极富含矿物质的环境中肺１。１９７６年，Ａ．Ｃｈｉｅｎ从中分离纯化到了耐热的ＴａｑＤＮＡ聚合酶Ｈ１。随着ＰＣＲ技术的推广和应用，对ＴａｑＤＮＡ聚合酶性质的研究日渐重要璐３。ＲａｎｄａｌｌＫ．Ｓａｉｋｉ首度将其应用于ＰＣＲ技术阳１，使得ＰＣＲ过程实现了自动连续循环。ＴａｑＤＮＡ聚合酶是一种耐热的ＤＮＡ聚合酶，属于ＤＮＡ聚合酶Ｉ家族。酶基因全长２４９６个碱基，编码８３２个氨基酸，分子量为９４ｋＤ。在７０—７５℃时具有最高的生物学活性。在９２．５℃酶活性可持续１３０ｍｉｎ，９５℃持续４０ｍｉｎ，９７．５℃５－６ｍｉｎ可保持约５０％的酶活性ｎ５第一章ＴａｑＤＮＡ聚合酶研究进展ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有５’一３’聚合酶活性以及５’一３’核酸外切酶活性。此外，还发现其具有焦磷酸酶活性…１，可以催化ｄｄＮＭＰ和ＰＰｉ反应生成ｄｄＮＴＰ。还具有非模板依赖性活性ｎ２｜，可以在ＤＮＡ分子的３’端引入非模板互补核苷酸Ａ，从而产生３’端突出单Ａ的ＰＣＲ产物。ＴａｑＤＮＡ聚合酶还被证实了具有逆转录活性［Ｋｑ，可以与ＰｆｕＤＮＡ聚合酶组合用于获得真核基因的ｃＤＮＡ。与常用的禽源ＡＭＶ反转录酶和鼠源Ｍｕｌｖ反转录酶相比在高温下进行反转录可以避免ｍＲＮＡ＿－一级结构所带来的不利影响。ＴａｑＤＮＡ聚合酶整个酶蛋白可以分为三个结构域，如图卜ｌ所示。Ｆｉｇｕｒｅ１－１．ＤｏｍａｉｎｓｏｆＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．ａｄｏｍａｉｎａｔｉｔｓａｍｉｎｏｔｅｒｍｉｎｕｓ（ｒｅｓｉｄｕｅ４２３）ｉｓ１ｔｏ２９１）ｔｈａｔｈａｓａ５＇－３’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ：ｉｎｔｈｅａｔｉｔｓｍｉｄｄｌｅ（ｒｅｓｉｄｕｅ８３２）ｔｈａｔｈａｓａ２９２ｔｏｔｈｅｓｅｃｏｎｄｄｏｍａｉｎ；ａｄｏｍａｉｎＣ－ｔｅｒｍｉｎｕｓ（ｒｅｓｉｄｕｅ４２４ｔｏ５＇－３’ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓａｃｔｉｖｉｔｙ．酶蛋白多肽链Ｎ端１－－２９１个氨基酸构成一个结构域，表达５’＿３’核酸外切酶活性，该活性可以对单链或者双链的ＤＮＡ分子５’端进行消化，释放出寡核苷酸。二价的金属离子的结合位点位于该区域，如图卜２所示。６第一章ＴａｑＤＮＡ聚合酶研究进展Ｆｉｇｕｒｅ１－２．Ｔｈｅ３Ｄ—ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｄｏｍａｉｎｏｆ５’－－＊３’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｏｆＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．位于蛋白质肽链的Ｃ末端的４２４－－８３２个氨基酸构成另一个结构域，表达５·＿３·聚合酶活性。此结构域，形象的被比作是人类的右手，可以分为拇指区域、手指区域以及手掌区域（图卜３）。ｏｆＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ·Ｆｉｇｕｒｅ１－３Ｔｈｅ３Ｄ·－ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｄｏｍａｉｎｏｆｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ其拇指区域用于结合引物一模板复合物ｎ４。１引，其它手指区域与单链的７第一章ＴａｑＤＮＡ聚合酶研究进展ＤＮＡ模板相互作用以及接纳ｄＮＴＰｓ，在每接纳一个ｄＮＴＰ的时候，手指的指尖部位就会发生构象的变化，向内侧移动而呈现一个闭合的结构ｎ钔。而手掌区域则是催化聚合反应的位置，同时也起到接纳ｄＮＴＰ的作用ｎ５’１８３。ＴａｑＤＮＡ聚合酶的第三个结构域位于酶蛋白肽链的中间部分，即２９２—４２３氨基酸区域。该区域与ＥｃｏｌｉＰｏｌＩ具有结构的同源性但是没有序列的同源性，所以ＴａｑＤＮＡ聚合酶不具有叵ｃｏｌｉＰｏｌＩ的３’一５’核酸外切酶活性‘１世界各国许多实验室对各种耐热ＤＮＡ聚合酶进行研究，发现了多种耐热的ＤＮＡ聚合酶。美国ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ公司从海底火山口中能在近１００℃高温下生长的Ｔｈｅｒｍｃｏｃｃｕｓ］ｉｔｏｒａｌｉｓ菌中提纯得到性能比ＴａｑＤＮＡ聚合酶更优越的另一个耐热酶．ｖｅｎｔ删ＤＮＡ聚合酶乜０１。该酶在１００。Ｃ时的半衰期达９５ｍｉｎ，此外还具有３’一５’核酸外切酶活性。在不断寻找新酶的基础上，许多实验室还致力于对ＴａｑＤＮＡ聚合酶的修饰和改造。§１．１提高ＴａｑＤＮＡ聚合酶的续进性§１．１．１通过酶的混合应用提高续进性由于ＴａｑＤＮＡ聚合酶缺乏校正功能，在ＰＣＲ链的延伸反应中常因为发生错配或因为ＤＮＡ模板高ＧＣ含量而终止，不能识别和切除不配对的ＤＮＡ生长链末端的核苷酸使延伸反应继续。扩增片段的长度很难超过６ｋｂｎ０。，了ＰＣＲ技术更为广泛的应用。１９９４年，Ｂａｒｎｅｓ乜妇和Ｃｈｅｎｇ乜２１成功建立了长链ＰＣＲ（１０ｎｇＰＣＲ）技术。将两种ＤＮＡ聚合酶联合应用，利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶较强的延伸能力和ＰｆｕＤＮＡ聚合酶等的校正功能。通过对缓冲液成分及热循环条件的优化，成功实现了长片段扩增。使得扩增长度可以达至Ｕ４０ｋｂ晗３１。§１．１．２通过酶的定点突变提高续进性ＴｔｈＤＮＡ聚合酶是一个有着扩增长片段能力的聚合酶陋４嗡１，用Ｘ射线对酶与核酸的复合物进行研究发现，酶第５４３位氨基酸一丝氨酸在酶与模板一引物复合物的相互作用中起着关键性的作用乜引。在Ｔｔｈ聚合酶中第５４３位氨基酸是天冬酰氨，而Ｔｔｈ聚合酶有着高的扩增长片段的能力，所以把ＴａｑＤＮＡ聚合酶第５４３位氨基酸一丝氨酸突变为天冬酰氨，该突变位点位于聚合酶的拇指结构域，增强了酶与模板一引物复合物的结合和相互作用，降低了对模板第一章ＴａｑＤＮＡ聚合酶研究进展结构的敏感性从而提高了对高ＧＣ含量等困难模板的扩增能力并使得扩增长片段（大于２ｋｂ）的能力增加几倍啪’２引。§１．１．３通过基因、蛋白质工程提高续进性Ｔ７ＤＮＡ聚合酶具有结合硫氧还蛋白的结构域。当Ｔ７ＤＮＡ聚合酶结合有硫氧还蛋白时，酶的续进性可提高１００倍，同时聚合的速度提高８０倍ｍ’３¨。所以在ＴａｑＤＮＡ聚合酶拇指结构域上插入与Ｔ７ＤＮＡ聚合酶高度同源的Ｔ３ＤＮＡ聚合酶硫氧还蛋白结构域，来提高ＴａｑＤＮＡ聚合酶的续进性。实验表明，在有硫氧还蛋白存在的条件下，ＴａｑＤＮＡｐｏｌ／ＴＢＤ酶的续进性比野生的ＴａｑＤＮＡ聚合酶增））１１２０－－５０倍口２Ｊ。同样也可以通过蛋白质工程技术将ＴａｑＤＮＡ聚合酶和非序列特异性的ｄｓＤＮＡ结合蛋白Ｓｓ０７ｄ融合，通过增强酶和ＤＮＡ模板的结合来增加酶的续进性口３Ｊ。§１．１．４通过消除ＴａｑＤＮｈ聚合酶５·＿３．夕｝切酶活性来提高续进性通过缺失突变构建缺少５’＿３’核酸外切酶活性的ＴａｑＤＮＡ聚合酶。１９８９年Ｌａｗｙｅｒ等人将ＴａｑＤＮＡ聚合酶去掉１－－２８９个氨基酸。Ｎ端缺少２８９个氨基酸的ＴａｑＤＮＡ聚合酶称为Ｓｔｏｆｅｌｌ片段，去除了５’＿３ｔ夕｜、切酶活性的Ｓｔｏｆｅｌｌ片段，它的聚合酶活性对离子浓度的依赖只有６０％，在低离子浓度环境下可以增加核酸一蛋白质复合物的稳定性并且可以降低聚合酶从模板上分离的速度，从而提高了酶的续进性ｂ４＿５１。§１．２提高ＴａｑＤＮＡ聚合酶的忠实性ＴａｑＤＮＡ聚合酶，由于缺乏３’一５’核酸外切酶活性一即校正功能，所以在ＤＮＡ合成过程中对单核苷酸错配没有校正功能，每一循环错配率达到２×１０叫核苷酸碱基，不能很好的保证ＰＣＲ产物的保真性ｎ们。Ｓｔｏｆｅｌｌ片段和ＫｌｅｎＴａｑＤＮＡ聚合酶是Ｎ端被删除的ＴａｑＤＮＡ聚合酶。略过了５。一３’端核酸外切酶结构域。用ＰＣＲ方法检ｉ９１１｝突变率，结果发现ＫｌｅｎＴａｑＤＮＡ聚合酶的突变率比全长的ＴａｑＤＮＡ聚合酶低两倍ｍ１，而Ｓｔｏｆｅｌｌ片段也是一种Ｎ端被删除的ＴａｑＤＮＡ聚合酶也具有较低的错配率［３５］通过在ＴａｑＤＮＡ聚合酶中插入硫氧还蛋白结构域，也可以增加酶的忠实性２—３倍口羽。９第一章ＴａｑＤＮＡ聚合酶研究进展§１．３提高ＴａｑＤＮＡ聚合酶耐热性ＴａｑＤＮＡ聚合酶通过缺失突变得到的Ｓｔｏｆｅｌ１片段耐热性也可以得到提高。实验表明，全长的ＴａｑＤＮＡ聚合酶经过９７．５＂Ｃ９分钟可以保持一半的活性，而Ｓｔｏｆｅｌｌ片段可以持续２１分钟口４１。而ＫｌｅｎＴａｑＤＮＡ聚合酶也具有较高的热的稳定性∞７１。§１．４通过点突变降低ＴａｑＤＮＡ聚合酶５’一３’外切酶活性ＴａｑＤＮＡ聚合酶所具有的５’一３’外切酶活性就是从５’＿÷３’方向水解ＤＮＡ生长链前方的ＤＮＡ链，主要产生５ｔ－脱氧核苷酸。这种酶活性只对ＤＮＡ上配对部份磷酸二酯键有切割活力作用，方向是５’＿÷３’。会对ＰＣＲ产物的片段进行酶切，影响ＰＣＲ扩增。将ＴａｑＤＮＡ聚合酶经过定点突变来降低其５’一３’外切酶活性。实验表明第２５第７４位氨基酸是表达５’＿÷３’外切酶活性的活性位点，则通过这两个位点的钝化来降低５’一３Ｉ夕ｐ切酶的活性船引。或者定点突变ＴａｑＤＮＡ聚合酶的第４６位氨基酸，将甘氨酸突变为天冬氨酸可以使酶的５’叶３’外切酶的活性下降１０００倍口９】。§１．５降低ＴａｑＤＮＡ聚合酶对ｄｄＮＴＰ的抵抗在基因工程中，常要进行ＤＮＡ的测序，将ＴａｑＤＮＡ聚合酶用于ＤＮＡ的测序，与普通的测序酶比较除了具有良好的链延伸性能外，还有可在高温中进行反应的优点。所以能够克服富含ＧＣ序列的模板形成自身二级结构对测序的影响。若将ＰＣＲ反应与末断终止法测序结合进行，则测序只需要少量的模板，对双链模板的测序不需要碱变性。ＴａｑＤＮＡ聚合酶的耐热性，可高温退火增强引物与模板结合的特异性。但是ＴａｑＤＮＡ聚合酶用于测序时对ｄｄＮＴＰ具有抵抗性，四种ｄｄＮＴＰ搀入的速度明显不同，尤其是ｄｄＧＴＰ搀入速率比，ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ和ｄｄＴＴＰ快１０倍呻“¨，造成测序时四种带的强度和峰的高低不均衡，不利于结果判读，影响测序结果的准确性。通过对酶晶体结构的研究，发现酶的第６６７位点的苯丙氨酸在对ｄｄＮＴＰ的选择性抵抗中起主要作用Ｈ２ｌ。以及酶第６６０位的氨基酸侧链，在ｄｄＧＴＰ和第６６０位氨基酸之间会形成氢键，导致ｄｄＧＴＰ的结合速度比其它三种快１０倍。实验表明，将６６７位点的苯丙氨酸突变为酪氨酸就可以降低对ｄｄＮＴＰｌＯ第一章ＴａｑＤＮＡ聚合酶研究进展的选择性抵抗作用Ｈ羽，当６６０位的精氨酸突变为天冬氨酸时，ｄｄＧＴＰ渗入的速度也可以达到最佳，从而达到较好的测序效果。§１．６提高ＴａｑＤＮＡ聚合酶最适反应温度实现热启动ＰＣＲＴａｑＤＮＡ聚合酶在２０。Ｃ一３７℃下仍有一定聚合酶活性Ｈ制，这对ＰＣＲ反应是不利的，容易产生非特异性的扩增以及产生引物二聚体。所以人们希望提高ＴａｑＤＮＡ聚合酶的最适反应温度以最大程度的降低这种不利的反应。除了利用低温操作、仪器预热、物理隔绝Ｈ５。４叩以及设计特殊引物碡¨２１的方法来达到热启动的目的外，还可以通过对ＴａｑＤＮＡ聚合酶的修饰来达到热启动ＰＣＲ的目的。§１．６．１化学修饰法对ＴａｑＤＮＡ聚合酶进行化学修饰，女ＩＡｍｐｌｉｔａｑＧｏｌｄ和ＨｏｔｓｔａｒｔＴａｑ这两种酶聆３Ｊ。但这两种酶的激活需要经过９５。Ｃ５－１５分钟且反应的ＰＨｉ８．３，这样容易导致ＤＮＡ的脱嘌呤和断裂畸４’５５｜，影响了酶的续进性和忠实性啼６侧。§１．６．２基因突变法对ＴａｑＤＮＡ聚合酶进行改造，先用基因工程的方法将ＴａｑＤＮＡ聚合酶Ｎ端２７８个氨基酸去除，然后再进行两次定点突变Ｅ６２６Ｋ和１７０７Ｌ，将酶的第６２６位的谷氨酸突变为赖氨酸以及７０７位的异亮氨酸突变为亮氨酸。使得酶的最适工作温度提高到６８℃并在９５。Ｃ依然保持活性，提高了ＰＣＲ反应的特异性，减少了非特异性的扩增，提高了反应的灵敏度Ｈ钔。对酶晶体结构的研究表明ＴａｑＤＮＡ聚合酶Ｎ端２７８个氨基酸去除即去除了酶５。＿÷３．夕ｆ’切酶活性结构域可以使得酶聚合活性结构域暴露，使得上述位点距离酶的活性位点变远，甲基之间的相互作用更为困难，并且突变后这两个位点的氨基酸与７４９位氨基酸电子的作用更强，从而起到热启动的作用。§１．６．３抗原抗体结合法用ＴａｑＤＮＡ聚合酶免疫实验动物获得抗ＴａｑＤＮＡ聚合酶的单抗或者多抗。在反应中，低温下酶与抗体形成抗原抗体复合物，使得聚合酶暂时失活。在较高温度下时，抗体变性，使得ＴａｑＤＮＡ聚合酶得以释放发挥活性。实现热启动ＰＣＲ暗哪！Ｊ。ＰＣＲ技术的出现是生命科学领域当之无愧的一场技术，没有一项技第一章ＴａｑＤＮＡ聚合酶研究进展术的发展和应用速度之快能与其相提并论。而将ＰＣＲ技术变成真正成熟技术的则是耐高温ＴａｑＤＮＡ聚合酶的引进。由此ＰＣＲ技术才真正地得到了推广，短短十几年，ＰＣＲ技术得到迅速发展，被广泛地应用于产前诊断、携带者检测、基因分型、基因诊断、定点诱变、ＤＮＡ序列测定以及ＤＮＡ多态性研究等医学和生物学的各个方面研究阳２哪！。因此，ＴａｑＤＮＡ聚合酶在ＰＣＲ技术中发挥着至关重要的作用。随着研究的逐渐深入，对ＴａｑＤＮＡ聚合酶进一步的修饰和改造将带来ＰＣＲ技术的又一次革新。参考文献【１】ＳａｉｋｉＲＬ，ＧｅｌｆａｎｄＤＨ，ＳｔｏｆｆｅｌＳ，ＳｃａｒｆＳＪ，ＨｉｇｕｃｈＲ，ＨｏｍａＧＴ，ＭｕｌｌｉｓＫＢ．ＰｒｉｍｅｒｄｉｒｅｃｔｅｄｅｎｚｙｍａｔｉｃａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＤＮＡｗｉｔｈＳｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２３０：１３５０—１３５４．ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ［Ｊ】．［２】ＳａｉｋｉＲＫｅｔａ１．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｌｏｂｉｎｇｅｎｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅａｎａｙｌｉｓｉｓｆｏｒｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｓｉｃｋｌｅｃｅｌｌａｎｅｍｉａ【Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２３０：１３５０－１３５４．ａ［３】ＭｕｌｌｉｓＫＢ，ｅｔａ１．ＳｐｅｃｉｆｉｃｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＤＮＡｉｎｖｉｔｒｏｖｉａｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ—ｃａｔａｌｙｚｅｄｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ［Ｊ】．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍａｌ，１９８７，１５５：３３５－３５０．【４］ＲｉｉｄｉｇｅｒＮ．Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ２００３，１６５（８）：７８３—５．［５】ＫｅｏｈａｖｏｎｇＤＮＡＰ．，ＫａｔＡ．Ｇ，ＣａｒｉｅｌｌｏＮ．Ｅ，Ｔｈｉｌｌｙｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ—ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅ【Ｊ】．ＵｇｅｓｋｒＬａｅｇｅｒ．Ｗ：ＧＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏｕｓｉｎｇＴ４ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ［Ｊ】．ＤＮＡ，１９８８，７（１）：６３—７０．ＴＤ．Ｔｈｅｖａｌｕｅｏｆｂａｓｉｃｒｅｓｅａｒｃｈ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆ［６］ＢｒｏｃｋＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓａｎｄｏｔｈｅｒｅｘｔｒｅｍｅｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ［Ｊ】．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９７，１４６（４）：１２０７－１２１０．［７】ＣｈｉｅｎＡ，ＥｄｇａｒＤＢ，ＴｒｅｌａＪＭ．ＤｅｏｘｙｆｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｆｒｏｍｔｈｅｅｘｔｒｅｍｅｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ．［Ｊ】．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７６，１２７（３）：１５５０—１５５７．【８］季朝能：杜汉森．ＴａｑＤＮＡ聚合酶功能区域的定位［Ｊ】．中国生物化学与分子生物学报，１９９９，１５（３）：４３２－４３５．［９】ＳａｉｋｉＲＬ，ＳｃａｒｆＳ，ＦａｌｏｏｎａＦ，ＭｕｌｌｉｓＫＢ，ＨｏｒｎＧＴ，ＥｒｉｃｈＨＡ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒｏｆｂｅｔａ－ｇｌｏｂｉｎｇｅｎｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｓｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｓｉｃｋｌｅ１２第一章ＴａｑＤＮＡ聚合酶研究进展ｃｅｌｌａｎｃｍｉａ［Ｊ】．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２３０：１３５０．１３５４．［１０】卢圣栋．现代分子生物学实用技术【Ｍ］．第二版．北京：中国协和医科大学出版社：１９９９．［１１】ＬｉｕＱ，Ｓｏｍｍｅｒａｌｌｅｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃＳＳ．Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｌｙｓｉｓ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ（ＰＡＰ）：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０００，２９（５）：１０７２．１０７６．ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｄｄｉｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎｓｃａｔａｌｙｚｅｄｂｙｐｒｏｃａｒｙｏｔｉｃＡｃｉｄＲｅｓ，１９８８，１【ｌ２】ＫｌａｒｋＪＭ．Ｎｏｖｅｌｎｏｎ－ｔｅｍｐｌａｔｅｄａｎｄｅｕｃａｒｙｏｔｉｅＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ【Ｊ１．Ｎｕｃｌ６（２０）：９６７７．９６８１．［１３１牛冬：赵艳：阮晖．ＴａｑｐｌｕｓＩＤＮＡ聚合酶的反转录活性［Ｊ】．中国兽医学报，２００６，２６（１）：５７．５８．【１４】Ｂｌａｎｃｏ，Ｌ．，Ｂｅｍａｄ，Ａ．，Ｂｌａｓｃｏ，Ｍ．Ａ．ａｎｄＳａｌａｓ，Ｍ．ＡＤＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＤＮＡｇｅｎｅｒａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｆｏｒｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ【Ｊ】．Ｇｅｎｅ，１９９１，１００：２７．２８．ａｎｄＳｔｅｉｔｚ，Ｔ．Ａ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｌａｒｇｅ［１５】Ｏｌｌｉｓ，Ｄ．Ｌ．，Ｂｉｃｋ，Ｒ．，Ｈａｍｌｉｎ，Ｒ．，Ｘｕｏｎｇ，Ｎ．ＧｆｒａｇｍｅｎｔｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１９８５，３１３：７６２—７６６．ＩｃｏｍｐｌｅｘｅｄｗｉｔｈｄＴＭＰ［Ｊ１．Ｎａｔｕｒｅ，【１６】Ｂｅｅｓｅ，Ｌ．Ｓ．，Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ，ＶａｎｄＳｔｅｉｔｚ，Ｔ．Ａ．ＴｈｅＴｈｕｍｂＳｕｂｄｏｍａｉｎＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＦｕｎｃｔｉｏｎｓｔｏｏｆＴ７ＲＮＡＳｔａｂｉｌｉｚｅｔｈｅＴｅｒｎａｒｙＣｏｍｐｌｅｘｄｕｒｉｎｇＰｒｏｃｅｓｓｉｖｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ［Ｊ】．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２６０：３５２．３５５．【１７］Ｋｉｍ，Ｙ，Ｅｏｍ，ＳＨ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｌｅｅ，ＤＳ．，Ｓｕｂ，Ｓ．Ｗ－ａｎｄＴｈｅｒｍｕｓＡｑｕａｔｉｃｓＤＮＡＳｔｅｉｔｚ，Ｔ．Ａ．ＣｒｙｓｔａｌＳｔｕｃｔｕｒｅｏｆＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ［Ｊ】．Ｎａｔｕｒｅ，１９９５，３７６：６１２．６１６．Ｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆｏｐｅｎａｎｄ［１８１Ｌｉ，Ｙ，Ｋｏｒｏｌｅｖ，Ｓ．ａｎｄＷａｋｓｍａｎ。ＧｃｌｏｓｅｄｆｏｒｍｓｏｆｂｉｎａｒｙａｎｄｔｅｒｎａｒｙｃｏｍｐｌｅｘｅｓｏｆｔｈｅｌａｒｇｅｆｒａｇｍｅｎｔｏｆＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｆｉｃｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｂａｓｉｓｆｏｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ【Ｊ］．ＥＭＢＯ，１９９８，１７：７５１４．７５２５．【１９】ＰａｒｋＹＣｈｏｉＨ，ＬｅｅＤＳ，ＫｉｍＹＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅ３’·５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｂｙｐｒｏｔｅｉｎ４１９－４２４．ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｉｎｔｈｅａｃｔｉｖｅｓｉｔｅ［Ｊ】．ＭｏｌＣｅｌｌｓ，１９９７，７（３）：［２０】Ｍａｔｔｉｌａ只ＫｏｒｐｅｌａＴｈｅｒｒｎｏｃｏｃｃｕｓＪ，ＴｅｎｋａｎｅｎＴ’ＰｉｔｋａｎｅｎＫ．ＦｉｄｅｌｉｔｙｏｆＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｂｙＤＮＡｔｈｅｌｉｔｏｒａｌｉｓｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ·－·－ａｌｌｅｘｔｒｅｍｅｌｙｈｅａｔｓｔａｂｌｅｅｎｚｙｍｅｗｉｔｈｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ】．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９１，１９（１８）：４９６７－４９７３．ｏｆｕｐｔｏ３５２ｋｂＤＮＡｗｉｔｈｈｉｇｈｆｉｌｄｅｌｉｔｙａｎｄｈｉｇｈｙｉｅｌｄ［２１】ＢａｒｎｅｓＷＭ．ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｒｏｍ九ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｔｅｍｐｌａｔｅｓ【Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ，１９９４，９１（６）：２２１６．２２２０．１气第一章ＴａｑＤＮＡ聚合酶研究进展［２２】ＣｈｅｎｇｃｌｏｎｅｄＳ，ＦｏｃｌｄｅｒＣ，ＢａｒｎｅｓｉｎｓｅｒｔｓＷＭ，ｅｔａ１．ＥｆｆｅｃｔｉｖｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｌｏｎｇｔａｒｇｅｔｓｆｒｏｍａｎｄｈｕｍａｎｇｅｏｎｍｉｃＤＮＡ［Ｊ】．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ，１９９４，９１（１２）：５６９５．５６９９．［２３】范宝昌．长链ＰＣＲ技术研究进展【Ｊ］．国外医学临床生物化学与检验学分册，２００３，２４（３）：１４８·１５０．【２４】Ｏｈｌｅｒ，Ｌ．Ｄ．ａｎｄＲｏｓｅ，Ｅ．Ａ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｌｏｎｇｄｉｓｔａｎｃｅ１－５９．ＰＣＲｕｓｉｎｇａＩｒａｎｓｐｏｓｏｎ－ｂａｓｅｄｍｏｄｅｌｓｙｓｔｅｍ．ＰＣＲ［Ｊ】．ＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌ，１９９２，２：５［２５】Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．，Ｆｏｃｋｌｅｒ，Ｃ．，Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．ａｎｄｔａｒｇｅｔｓｆｒｏｍｃｌｏｎｅｄｉｎｓｅｒｔｓ５６９５—５６９９．ａｎｄＨｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅａｍｐｌｉｆｉ－ｃａｔｉｏｎｏｆｌｏｎｇａｎｄｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ［Ｊ】．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ，１９９４，９１：【２６】Ｉｇｎａｔｏｖ，Ｋ．Ｂ．，Ｋｒａｍａｒｏｖ，ＶＭ．，Ｃｈｉｓｔｙａｋｏｖａ，Ｌ．ＧＭｉｒｏｓｈｎｉｋｏｖ，Ａ．Ｉ．ＦａｃｔｏｒｓｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙｏｆＴｔｈａｎｄＴａｑＤＮＡ—ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓｉｎａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｈａｇｅ１ＤＮＡ［Ｊ］．Ｍｏｌ。Ｂｉｏｌ，１９９７，３１：９５６—９６１．Ｓｔｅｉｔｚ，Ｔ．Ａ．ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＴａｑｐｌｏｙｍｅｒａｓｅ、析ｔ１１ＤＮＡａｔｔｈｅ【２７］Ｅｏｍ，Ｓ．Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．ａｎｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｃｔｉｖｅｓｉｔｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ１９９６，３８２：２７８—２８１．［２８］Ｋ．Ｂ．Ｉｇｎａｔｏｖ，Ａ．Ａ．Ｂａｓｈｉｒｏｖａ，Ａ．Ｉ．Ｍｉｒｏｓｈｎｉｋｏｖ，ＶＭ．Ｋｒａｍａｒｏｖ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ￥５４３ＮｉｎｔｈｅｔｈｕｍｂｓｕｂｄｏｍａｉｎｏｆｔｈｅＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｌａｒｇｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄ、Ⅳｉｔｌｌｔｈｅｆｒａｇｍｅｎｔｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｐａｕｓｉｎｇｔｅｍｐｌａｔｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．［Ｊ］．ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，１９９９，４４８：１４５－１４８．ｏｆＡｓｎｆｏｒＳｅｒ５４３ｉｎｔｈｅ【２９】Ｋ．Ｂ．Ｉｇｎａｔｏｖ，Ａ．Ｉ．Ｍｉｒｏｓｈｕｉｋｏｖ，ＶＭ．Ｋｒａｍａｒｏｖ．ＳｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｌａｒｇｅｆｒａｇｍｅｎｔｏｆＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｉｎｃｒｅａｓｅｓｔｈｅｅｆｃｉｅｎｃｙｏｆｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｌｏｎｇＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌｅｓ［Ｊ］．ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，１９９８，４２５：２４９—２５０．ｃｏｌｉ［３０】Ｔａｂｏｒ，Ｓ．，Ｈｕｂｃｒ，Ｈ．Ｅ．ａｎｄＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，ＣＣ．ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙｏｎｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎｃｏｎｆｅｒｓｔｈｅＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｇｅｎｅ５ｐｒｏｔｅｉｎｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＴ７［Ｊ】．Ｂｉ０１．Ｃｈｅｍ．，１９８７，２６２：１６２１２·１６２２３．【３１】Ｈｕｂｅｒ，Ｈ．Ｅ．，Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ａｎｄＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，ＣＣ．ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎｓｔａｂｉｌｉｚｅｓｃｏｍｐｌｅｘｅｓｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＴ７ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｎｄｐｒｉｍｅｄｔｅｍｐｌａｔｅｓ［Ｊ】．Ｂｉ０１．Ｃｈｅｍ．，１９８７，２６２：１６２２４·１６２３２．【３２］ＪｏｈｎＥＤａｖｉｄｓｏｎ，ＲｉｃｈａｒｄＦｏｘ，ＤａｗｎＤ．Ｈａｒｒｉｓ，ＳａｌｌｙＬｙｏｎｓ－ＡｂｂｏｔｔａｎｄＬａｗｒｅｎｃｅＡ．ｔｈｅＬｏｅｂ．ＩｎｓｅｒｔｉｏｎｏｆｔｈｅＴ３ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｅｎｈａｎｃｅｓｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙａｎｄｆｉｄｅｌｉｔｙｏｆＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ［Ｊ】．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２００３，１４第一章ＴａｑＤＮＡ聚合酶研究进展３ｌ（１６）：４７０２－４７０９．【３３】ＹａｈＷａｎｇ，ＤｅｎｎｉｓＶａｎｄｅｒＥ．Ｐｒｏｓｅｎ，ＬｉＭｅｉ，ＪｏｈｎＣ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，ＭｉｃｈａｅｌＦｉｎｎｅｙａｎｄＰｅｔｅｒＢ．ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙＨｏｍ．ＡｎｏｖｅｌｓｔｒａｔｅｇｙｔｏｅｎｇｉｎｅｅｒＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓｆｏｒｉｎｅｎｈａｎｃｅｄａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ１１９７．１２０７．ｖｉｔｒｏ【Ｊ】．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２００４，３２（３）：【３４】ＦｒａｎｃｅｓＣ．１ａｗｙｅｒ，ＳｕｓａｎｎｅＳｔｏｆｆｅｌ，ＲａｎｄａｌｌＫ．Ｓａｉｋｉ，Ｓｈｅｎｇ－ＹｕｎｇＣｈａｎｇ．Ｈｉｇｈ·ｌｅｖｅｌＴｈｅｒｍｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄＥｎｚｙｍａｔｉｃＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡｏｆＦｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈＰｏｌｖｍｅｒａｓｅａｎｄａＴｒｕｎｃａｔｅｄＦｏｒｍＤｅｆｉｃｉｅｎｔｉｎ５＇－３’．ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＡｃｔｉｖｉｔｙ【Ｊ】．ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．１［３５】ＤａｂｒｏｗｓｋｉＳ，Ｋｕｒ９９３，２：２７５—２８７．Ｊ．ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨｉｓ－ｔａｇｇｅｄＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．ＩＩ．ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡＡｃｔａＢｉｏｃｈｉｍｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｏｆｆｅｌｆｒａｇｍｅｎｔ）［Ｊ】－Ｐｏｌ，１９９８，４５（３）：６６１－７．ｆｉｄｅｌｉｔｙｏｆＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃａｔａｌｙｚｉｎｇＰＣＲｉｓ［３６】ＢａｒｎｅｓＷＭ．ＴｈｅｉｍｐｒｏｖｅｄｂｙａｎＮ—ｔｅｒｍｉｎａｌｄｅｌｅｔｉｏｎ【Ｊ】．Ｇｅｎｅ，１９９２，１１２（１）：２９－３５．【３７］Ｂａｒｎｅｓ，Ｗａｙｎｅｅｎｈａｎｃｅｄ５，４３６，１４９．ｌｅｎｇｔｈＭ．ＴｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ谢ｍｅｎｈａｎｃｅｄａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｐｒｉｍｅｒｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｅｘｔｅｎｓｉｏｎ【Ｐ】．ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰａｔｅｎｔ．，１９９５，【３８］ＭｅｒｋｅｎｓＬＳ，ＢｒｙａｎＳＫ，ＭｏｓｅｓＲＥ．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ５＇－３’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｏｆＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．［Ｊ】．ＢｉｏｃｈｉｒｎＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，１９９５，１２６４（２）：２４３－２４８．【３９］Ａｂｒａｍｓｏｎ，Ｒｉｃｈａｒｄ【Ｐ】．Ｕｎｉｔｅｄ［４０］ＹｉｎｇＤ．５’ｔｏ３’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓＳｔａｔｅｓＰａｔｅｎｔ，１９９８，５，７９５，７６２．Ｌｉ，ＶｅｓｓｅｌｉｎＭｉｔａｘｏｖ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄｏｆｄｅｓｉｇｎｏｆＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓｗｉｔｈｉｍｐｒｏｖｅｄｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ［Ｊ】．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９９，９６：９４９１—９４９６．［４１】Ｂｒａｎｄｉｓ，Ｊ．Ｗ：，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｓ．ＧｆｏｒｍａｔｉｏｎａｃｃｏｕｎｔｓａｎｄＪｏｈｎｓｏｎ，ｋＡ．ＳｌｏｗｒａｔｅｂｉａｓｏｆｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒｂｏｎｄｓｈｏｗｓｆｏｒｔｈｅｓｔｒｏｎｇｔｈａｔＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｇａｉｎｓｔ２＇，３＇－ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ［Ｊ】。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，３５：２１８９—２２００．ｏｆｔｈｅＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ【４２】Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ａｎｄＣ．Ｃ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ．ＡｓｉｎｇｌｅｒｅｓｉｄｕｅｉｎＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓｃｏｌｉＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩｆａｍｉｌｙｉｓｃｒｉｔｉｃａｌｆｏｒｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇｂｅｔｗｅｅｎｄｅｏｘｙ－ａｎｄｄｉｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ［Ｊ】．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，１９９５，９２：６３３９—６３４３．１５第一章ＴａｑＤＮＡ聚合酶研究进展［４３】ＬｉｎｄａＴ－ＡｍｐｌｉＴａｑＨｅｉｇｈｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＦＳＤｙｅ－ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＰｅａｋＰａｔｔｅｒｎｓ［Ｊ】．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９６，２１：６９４－６９９．Ｔｚｅｋｏｖａｎｄ【４４】ＭｉｌｋｏＢ．Ｋｅｒｍｅｋｃｈｉｅｖ，ＡｎａｔｏｌｙｏｆＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｐｒｏｖｉｄｅＷａｙｎｅＭ．Ｂａｒｎｅｓ．Ｃｏｌｄ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｕｔａｎｔｓＰＣＲ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２００３，ａｈｏｔｓｔａｒｔｆｏｒ３１（２１）：６１３９－６１４７．［４５】ＬｅｉＰｉｎｇ，ＹａｎｇＳｈｕｉ—ｙｕｎ，ＬｉＹｕ－ｅ．Ａｓｉｍｐｌｅｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍｅｔｈｏｄｔｏａｃｈｉｅｖｅｈｏｔ－ｓｔａｒｔｉｎＩｎＰＣＲ［Ｊ】．ＬｅｔｔｅｒｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，．２００３，１４（５）：４０３．Ｐｏｔｗｏｒｏｗｓｋｉ，Ｅ．ＥａｎｄＴｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．ＩｎｃｒｅａｓｅｄＰＣＲｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｂｙｒｅａｃｔｉｏｎ［４６］Ｈｅｂｅｒｔ，Ｂ．，Ｂｅｒｇｅｒｏｎ¨Ｊｕｓｉｎｇｐａｒａｆｆｉｎｗａｘａｓａｍｉｘｏｖｅｒｌａｙ【Ｊ］．Ｍ０１．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１９９３，７：２４９－２５２．Ｌｉｎｄｓｔｏｍ，Ｋ．Ａｎｂｅａｄｓｏｆａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｈｏｔｓｔａｒｔ［４７］Ｋａｉｊａｌａｉｎｅｎ，Ｓ．，Ｋａｒｈｕｎｅｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｌａｌｕ，Ｋ．ａｎｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒＰＣＲｉｎｓｍａｌｌｖｏｌｕｍｅｓｕｓｉｎｇＷａＸ－ｅｍｂｅｄｄｅｄｒｅａｃｔｉｏｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｄｒｉｅｄｉｎｔｒｅｈａｌｏｓｅ［Ｊ】．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９３，２１：２９５９－２９６０．［４８］Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｈｏｐｐｅ，Ｂ．Ｌ．ａｎｄＣｏｎｔｉ—Ｔｒｏｎｃｏｎｉｋ，Ｂ．Ｍ．ＡｍｐｌｉＧｒｅａｓｅ：、ｈｏｔｕｓｉｎｇｓｔａｒｔ’ＰＣＲｐｅｔｒｏｌｅｕｍｊｅｌｌｙ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９４，１６：４２＿４３．Ｓｅｖｉｇｎｙ，Ｅ［４９】Ｒａｍａｎｕｊａｍ，Ｒ．，Ｂｕｒｄｉｃｋ，Ｂ．Ａ．，Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．Ｄ．ａｎｄＭｅｔｈｏｄａｎｄｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｆｏｒｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｗａｘ—ｅｍｂｅｄｄｅｄ，ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｒｅａｇｅｎｔｓ［Ｐ］．ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰａｔｅｎｔ．，１９９７，５，５９９，６６０．Ｂａｈｒｍａｎｄ，Ａ．Ｒ．ＰＣＲｈｏｔｓｔａｒｔｕｓｉｎｇ［５０］Ｋａｂｏｅｖ，Ｏ．ＩＣ，Ｌｕｃｈｋｉｎａ，Ｌ．Ａ．，Ｔｒｅｔｉａｋｏｖ，Ａ．Ｎ．ａｎｄｐｒｉｍｅｒｓ谢ｍＡｃｉｄｓｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎｓ（ｈａｉｒｐｉｎ—ｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）［Ｊ】．ＮｕｃｌｅｉｃＲｅｓ，２０００，２８：９４—１０２．ｈｏｔ－ｓｔａｒｔＰＣＲ：【５ｌ】．Ｋａｉｎｚ，Ｐ．，Ｓｃｈｍｉｅｄｌｅｃｈｎｅｒ，Ａ．ａｎｄＳｔｒａｃｋ，Ｈ．Ｂ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｅｎｈａｎｃｅｄａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓａｄａｐｔｅｄｔｏｔｈｅａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ叨．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０００，２８：２７８—２８２．［５２］Ｄａｎｇ，Ｃ．ａｎｄＪａｙａｓｅｎａ，Ｓ．Ｄ．ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｌｏｗｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒｔａｒｇｅｔｓｂｙ２６８—２７８．ＰＣＲ．［Ｊ】．Ｍ０１．Ｂｉ０１．，１９９６，２６４：【５３】Ｍｏｒｅｔｔｉ，Ｔ．，Ｋｏｏｎｓ，Ｂ．ａｎｄＢｕｄｏｗｌｅ，Ｂ．ＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｙｉｅｌｄａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ７１６．７２２．ｕｓｉｎｇＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ【Ｊ】．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９８，２５：［５４】Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｔ．ａｎｄＮｙｂｅｒｇ，Ｂ．Ｒａｔｅｏｆｄｅｐｕｒｉｎａｔｉｏｎｏｆｎａｔｉｖｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ１６ａｃｉｄ［Ｊ】．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７２．１１：３６１ｌ。３６１８·【５５】．Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｔ．Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ７０９．７１５．ａｎｄｄｅｃａｙｏｆｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＤＮＡ【Ｊ】．Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６２：【５６】Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．ＰＣＲｆｒｏｍｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅａｎｄｈｉｇｈｙｉｅｌｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｕｐｔｏ３５ｋｂＤＮＡｗｉｔｈｈｉｇｈｆｉｄｄｉｔｙｔｅｍｐｌａｔｅｓ［Ｊ】．Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ，１９９４，９１：２２１６－２２２０·ｏｆｌｏｎｇ［５７１．Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．，Ｆｏｄｄｅｒ，Ｃ．，Ｂａｍｅｓ，Ｗ．Ｍ．ａｎｄＨｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｔａｒｇｅｔｓｆｒｏｍｃｌｏｎｅｄｉｎｓｅｒｔｓ９１：５６９５．５６９９．ａｎｄｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ［Ｊ】．Ｐｒｏｅ．ＮａｔｌＡｃａｄ·Ｓｃｉ·，１９９４，［５８１Ｂａｒｎｅｓ．Ｗ．Ｍ．Ｔｉｐｓａｎｄｔｒｉｃｋｓ１９：３４２．ｆｏｒｌｏｎｇａｎｄａｃｃｕｒａｔｅＰＣＲ［Ｊ】．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ·Ｓｃｉ，１９９４，【５９】Ｓｃａｌｉｃｅ，Ｅ．Ｒ。，Ｓｈａｒｋｅｙ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄＤａｉｓｓ，Ｊ．Ｌ．ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｆｒｏｍＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓａｒｅｐｒｅｐａｒｅｄａｇａｉｎｓｔｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ【Ｊ］．Ｉｍｍｕｎ０１．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９４，１７２：１４７－１６３．［６０】Ｋｅｌｌｏｇｇ，Ｄ…ＥＲｙｂａｌｋｉｎ—ＩＣｈｅｎ…ＳＭｕｋｈａｍｅｄｏｖａ，Ｎ．，Ｖｌａｓｉｋ，Ｔ．，Ｓｉｅｂｅｒｔ，ＥＤ·ａｎｄａＣｈｅｎｃｈｉｋ，Ａ．ＴａｑＳｔａｒｔａｎｔｉｂｏｄｙａｎｔｉｂｏｄｙ：’ｈｏｔｓｔａｒｔ’ＰＣＲｆａｃｆｌｉｍｔｅｄｂｙｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｄｉｒｅｃｔｅｄａｇａｉｎｓｔＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ［Ｊ】．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９４，１６：１１３４．１１３７．【６１］Ｓｈａｒｋｅｙ，Ｄ。ＪＳｃａｌｉｃｅ，Ｅ．Ｒ．，Ｃｈｒｉｓｔｙ，Ｋ．Ｇ，Ａｔｗｏｏｄ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄＤａｉｓｓ，Ｊ·Ｌ－Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｓｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅｓｗｉｔｃｈｅｓ：ｈｉｇｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇｆｏｒｔｈｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ【Ｊ】·Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９４，１２：５０６－５０９．［６２】Ｗｒｉｇｈｔ．ＰＡ，Ｗｙｎｆｏｒｄ－Ｔｈｏｍａｓ．Ｄ．Ｔｈｅｃｒｉｔｉｃａｌｒｅｖｉｅｗｏｆｉｔｓｕｓｅｓｐｏｌｙｒｎｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ：ｍｉｒａｃｌｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｒｍｉｒａｇｅＡａｎｄｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓｉｎａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈ【Ｊ１．Ｐａｔｈｏｌ，１９９０，１６２（２）：９９—１１７．［６３１ＨｕｍｍｅｌＭ．Ｃｒｉｔｅｒｉａｆｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓｉｎｐａｔｈｏｌｏｇｙ［ＪｌＶｅｒｈＤｔｓｃｈＧｅｓＰａｔｈｏｌ，１９９４，７８：１６１—１６５．［６４】ＬｉｅＡＩＣＤＮＡａｎａｌｙｓｅｓｉｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｐａｔｈｏｌｏｇｙ【Ｊ】．ＴｉｄｓｓｋｒＮｏｒＬａｅｇｅｆｏｒｅｎ，２０００，１２０（５）：５８９－５９４．［６５】ＬｉｓｂｙＧ．Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ：ｕｓｅｉｎｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓｖ【Ｊ】．ＵｇｅｓｋｒＬａｅｇｅｒ，１９９３，１５５（２２）：１７０８－１７１２．［６６】ＭｏｒｉｎｅｔＥＰｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ｉｎｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ［Ｍ】．Ｖａｌｕｅａｎｄ１７ｐｒａｃｔｉｃａｌ第一章ＴａｑＤＮＡ聚合酶研究进展ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＰｒｅｓｓｅ，１９９２，２１（２９）：１３７７－１３８０．ＷｊＫｎｕｔｓｓｏｎＲＢｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌｕｓｅ［６７】ＬａｎｔｚＰＧＡｂｕａｌ－ＳｏｕｄｏｆｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎＡｎｎａＲｅｖ，２０００，５：ｆｏｒｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ８７．１３０．ｓａｍｐｌｅｓ［Ｊ】－Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ【６８］ＪｌｉｇｅｒＵ，ＬａｃｚｉｋａＫ，ＳｃｈｏｌｔｅｎＣ，ＭｉｔｔｅｒｂａｕｅｒＭ，ＮｏｖａｋＭ，ＬｅｃｈｎｅｒＫ．Ｃｌｉｎｉｃａｌｕｓｅｏｆｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｉｎｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｏｆｍａｌｉｇｎａｎｔｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］．ＷｉｅｎＫｌｉｎＷｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．１９９６．１０８（２０）：６３４－６３９．１８第二章ＴａｑＤＮＡ聚合酶的改造第二章ＴａｑＤＮＡ聚合酶的改造第一节引言为了消除ＴａｑＤＮＡ聚合酶５’＿３哕｝、切酶活性对ＰＣＲ反应带来的不利影响，以及降低聚合酶对ｄｄＮＴＰ的抵抗，我们也尝试采取基因突变的方法对ＴａｑＤＮＡ聚合酶进行改造。８０年代以后人们利用分子克隆技术建立了体外点突变的方法，并利用这种方法在已知的序列中增删或转换核苷酸，特异地产生实验所设计的突变。而定点突变技术是改造、优化基因常用的手段，也是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有效方法，在医学上还可用于基因治疗等。．目前有许多突变的方法，有聚核苷酸介导的定点突变法、双引物定点突变法以及盒式突变法等。而基于ＰＣＲ的定点突变技术由于其突变效率高，操作简单，耗时短，成本低廉等优点而倍受瞩目。有重叠延＇ｆｑ甘ＰＣＰ，（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｅｘｔｅｎｓｉｏｎＰＣＲ，ＯＥ—ＰＣＲ）法ｎ吲、大引物ＰＣＲ法（ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒＰＣＲ）∞’７１、以及一些位于特殊位点的碱基可以通过设计含有酶切位点的引物，扩增后进行酶切连接达到定点突变目的的方法阴。１０Ｊ。重叠延ｔ＇＊ＰＣＲ法通过设计两个ＰＣＲ反应以产生两个含突变位点的ＤＮＡ片段，随后将上述两个ＰＣＲ产物混合，二者通过末端互补区结合，并在适宜的温度下互为引物延伸得到完整的含突变的基因。该技术可以实现基因定点突变，还能便利地实现大片段的插入及删除。但是反应需要两对引物和３次ＰＣＲ，并且需对中间产物进行纯化。相对而言步骤较烦琐，不经济；产物得率很低，还可能产生非预期的移码突变。后来虽然有许多学者对该技术进行了改进ｎ１。１引，但操作仍较烦琐，成本偏高。大引物ＰＣＲ法的基本原理是设计一个ＰＣＲ反应，产生一个含突变的ＤＮＡ片段，然后再以此ＤＮＡ片段作为引物与原模板退火进行ＰＣＲ扩增得到含突变的完整的基因。只需三个引物，两个ＰＣＲ反应，而且无需中间产物纯化等步骤ｎ钔。但该法操作仍较烦琐。而对于特殊位点碱基的定点突变，需要在突变位点附近含有唯一的酶切位点或者突变位点位于基因的末端，所以该方法的运用受到很大的，不具有普适性。我们则采用扩增环状质粒全长的方法进行定点突变，经过１次ＰＣＲ反应、１９第二章ＴａｑＤＮＡ聚合酶的改造１次酶解和１次转化，即完成了基因的定点突变。第二节材料与方法§２．１材料含ＴａｑＤＮＡ聚合酶基因的质粒，ｐＳＥ３８０，ＤＨ５ａ及ＢＬ２１（均为本实验室保存）；扩增引物，测序引物，突变引物（均为上海Ｓａｎｇｏｎ公司合成）；ＴａｑＤＮＡ聚合酶（上海Ｓａｎｇｏｎ公司产品）；溶菌酶、各种性内切酶、连接酶、ｄＮＴＰｓ（ＴａＫａＲａ大连宝生物工程有限公司）；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒（０ＭＥＧＡ）；ＰｆｕＤＮＡ聚合酶（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）：其它化学试剂均为国产分析纯。§２．２．方法§２．２．１定点突变方法方法包括如下步骤：１）根据酶基因设计突变引物；２）互补引物和质粒结合，在Ｐｆｕ酶作用下延伸成具有一个缺口的环形质粒；３）在ＤｐｎＩ作用下消化掉原来未突变的模板；４）消化完全的ＰＣＲ产物转化到感受态细胞中并修复缺口。ＴａｑＤＮＡ聚合酶基因：ＡＴＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＴＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＧＣＣＴＡＣＣＧＣＡＣＣＴＴＣＣＡＣＧＣＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＣＴＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＣＧＧＧＧＧＧＡＧ第４６位ＧＡＣＧＧＧＧＡＣＧＣＧＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＴＣＴＴＴＧＡＣＣＫ：ＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＴＣＣＧＣＣＡＣ氨基酸ＧＡＧＧＣＣＴＡＣＧＧＧＧＧＧｌ：ＡＣＡＡＧＧＣＧＧＧＣＣＣ碱ＣＣＣＣＡＣＧＣＣＧＧＡＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＣＧＧＣＡＬＡＣＴＣＧＣＣＣＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＣＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣ记ＧＣＧＣＣＴＣＧＡＧＧＴＣＣＣＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＧＴＣＣＧＣＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＡＧＡＣＣＴｒＩ＇ＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＣＣＧＡＣＣＧＣＡｒｒＣＡＣＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＧＡＧＧＧ旧ＴＡＣＣＴＣＡＴＣＡＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＴＴＴＧＧＧＡＡＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＴＧＡＧＧＣＣＣＧＡＣＣＡＧＴＧＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＣＧＧＧＣＣＣＴＧＡＣＣＧＧＧ旧ＡＣＧＡＧＴＣＣＧＡＣＡＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＧＧＧＡ第二章ＴａｑＤＮＡ聚合酶的改造ＧＡＡＧＡＣＧＧＣＧＡＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴ删ＡＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＧＡＣＣＧＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＣＣＡＴＣＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＧＣⅪＣＣＡＣＡＴＧＧＡＣＧＡＴＣＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣＣＴＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＧＣＡＣＣＧＡＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＡＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣ＿ＷⅪＴＴＡ删ＣＴＴｒＣＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＧＡ．ＧＴＴＣＧＣ沱ＣＴｒＣＴＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡ（弛～ＧＧＣＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＧＣＣＧＧＡＡＣＷ＿Ｗ＿ＷⅪＣＴＴＣＧＴＧＧＣ论ＴＴＴＧＴＧＣＴＴＴＣＣＣＧＣＡＡＧＧＡＧＣＣＣＡＴＧＴＧＧＣ把ＣＧＡＴＣＴＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣⅪＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＧＧＧＧＧＣＣＧＧＧＴＣＣＡＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＧＡＧＣＣＴＴＩ锄ＡＡＧＣＣＣＴＣＡＧＣＫ］ＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＧＣＧＧＧＧＧＣＴＴＣＴＣＧＣＣＡＡＡＧＡＣＣＴＧＡＧＣＧＴＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣ＿Ｋ］ＡＡＧＧＣＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＣＧＣＣＣＧＧＣＧＡＣＧＡＣＣＣＣＡＴＧＣＴＣＣＴＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＴｒＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＴＡＣＧＧＣ嗍ＡＧＴＧＧＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＧＣＣＧＣＣＣＴＴＴＣＣＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣＧＣＣＡＡＣＣＴＧＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＡＧＧＧＧＧ－ＡＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＴＴＡＣＣＧＣＫ３ＡＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＣＣＣＴＴＴＣＣＧＣＴＧＴＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＡＣＧＧＧＧＧＴＧＣＧＣＣＴＧＧＡＣＧＴＧＧＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＧＧＣＣＴＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＧＡＧＡＴＣＧＣＣＣＧＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＴＣＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＡＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＣＴＣＡＡＣＴＣＣＣＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣＣＴＣＴＴＴＧＡＣＧＡＧＣＴＡＧＧＧＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＧＧＣＡＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＴＣＣＧＣＧＡＧＧＣＣＣＡＣＣＣＣＡｒＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＴＡＣＣ僦ＴＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＴＡＧＣＴＣＣＧＡＴＣＣＧＣＡＣＣＴＡＣＡ：ｒＴＧＡＣＣＣＣＴＴＧＣＣＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＣＣＡＧＧＡＣＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＡＣＣＣＧＣＴＴＣＡＡＣＣＡＧＡＣＧＧＣＣＡＣＧＣⅪＣＡＣ跚ＡＧＧＣＴＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＣＣＣＧＴＣＣＧＣＡＣＣＣＣＧＣＴＴＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＧＡＧＧＡＧＧＧＧＴＧＧＣＴ肿ＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＡＧＣＣＡＧＡＴＡＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＴＣＴＣＣＧＧＣＧＡＣＧＡＧＡＡＣＣＴＧＡＴＣＣＧＣ＿玲ＴＣＴｒＣＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＣＧＧＡＧＡＣＣ（ｊＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＴＴＣＧＣ汇（汀ＣＣＣＣＣＧＧ眵元瓦砭砜ＡＴＧＴＣＧＣⅪＣＣＡＣＣＧＣＣＴＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴＡＧＣＣＡＴＣＣＣＴＴＡＣＧＡＧＧＧＡＩＴＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧ（讧ＡＣＧＴＧＧＡＧＡＣＣＣＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＴＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＡＴＧＣＧＣｃ删蟹塑坠型避坐丛四望竺型－６６７氨基酸ＡＧＧＣＣＣＡＧＧＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＧＣＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＧＡＧＣＴＴＣＣＣＣＡＡＧＧＴＧＣＧ－ＧＣ抡ＣＴＧＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＡＣＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＧＧＧＴＧＡＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＧ２１第二章ＴａｑＤＮＡ聚合酶的改造ＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＧＣＣＣＧＴＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＡＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＡＡ—盯ＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＴＧＣＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＣＣＡＣＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＴＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＣＣＡＡＴＡＧＡＧＡＧＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＧＴＧＧＣＣＣＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＴＡｒＣＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＡＩＡＧＧＧＧＡＧＧＡＣＴ（硒ＣＴＣＴＣＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＴ（了Ａ§２．２．１．１ｆ１４６ＤｍｕｒａｔｉｏｆｆＴａｑ§２．２．１．１．１ＤＮＡ聚合酶质粒的提取为了将酶基因的第４６位氨基酸甘氨酸突变为天冬氨酸。本实验中以ＴａｑＤＮＡ聚合酶基因作为模板进行定点突变。首先，将转化了含有ＴａｑＤＮＡ聚合酶基因质粒的大肠杆菌划平板后挑单菌落，接种于５ｍＬＬＢ液体培养基（含氨苄１００１ｘｇ／ｍＬ）中，３７℃振荡培养过夜．然后按照质粒提取试剂盒的步骤提取质粒．最后用ＴＥ溶液（１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ—ＨＣｌｐＨ８．０，２．Ｏｎｕｎｏｌ／ＬＭｇＣｌ２）溶解质粒并稀释到终浓度约为５０ｎｇ／“Ｌ一２０℃储存备用。§２．２．１．１．２ＥｃｏｌｉＤＨ５ａ感受态细胞的制备挑取单菌落至２ｍＬＬＢ液体培养基中，３７＂Ｃ振荡过夜．取５００９Ｌ过夜培养的菌液，接种于５０ＥＬＬＢ液体培养基中，培养至ｏＤ咖＝０．３左右，转移到５０ｍＬ灭过菌的离心管中，冰浴３０ｍｉｎ后，在４＂Ｃ条件下４，０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ．弃去上清，加入３０ｍＬ０．１ｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ：一ＣａＣｌ：溶液悬浮沉淀，冰浴５ｍｉｎ，在４＂Ｃ条件下４，０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ．弃上清，加入２ｍＬ含１５％甘油的ＣａＣｌ：（浓度为０．１ｍｏｌ／Ｌ）溶液悬浮细胞，每管按２００１ｘＬ分装，－８０＂Ｃ保存备用。§２．２．１．１．３ＴａｑＤＮＡ聚合酶质粒的定点突变将提好的含有酶基因的质粒，进行ＰＣＲ扩增。合成的扩增引物即突变引物，包含了需要突变的位点，且已经替换了所需要突变的碱基。扩增后，利用酶消化原来的母板，即作为初始模板的未突变的酶基因模板。将ＰＣＲ的产物，即含有突变后的酶基因的质粒转化到感受态细胞中（图２—１）。挑克隆即可得到含突变型酶基因的质粒。５０１ｘＬＰＣＲ反应体系：１０Ｘｂｕｆｆｅｒ（１００ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ，１００ｍｍｏｌ／Ｌ第二章ＴａｑＤＮＡ聚合酶的改造（ＮＨ４）：ＳＯ，，２００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ—ＨＣｌｐＨ８．８，２０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＳＯ。，１％ＴｒｉｔｏｎＸ一１００，ｌｍｇ／ｍＬＢＳＡ）５ｐＬ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ０．５ｐＬ，突变引物各１２５ｎｇ，１Ｕｐｆｕ酶，含５０ｎｇ质粒模板ｌｐＬ，）ＪＨｄｄＨ。０至５０ｐＬ。反应条件：９５℃变性３０ｓ，循环周期为９５℃３０ｓ，５５℃ｌｍｉｎ，６８℃１４ｍｉｎ，２５个循环。ＰＣＲ反应结束后立即将反应管放在冰上使其温度≤３７℃。然后加入１此的性内切酶ＰｐｎＩ放置在３７。Ｃ的恒温箱中酶解ｌｄ，时，消化掉原来未突变的模板，最后将消化后的ＰＣＲ产物转化到感受态细胞中。引物设计规则：引物中必须包含突变的位点，其它序列和原基因序列完全互补，且设计时引物长度控制在２５—４５ｂｐ，尽量使得退火温度≥７８℃．使得引物可以很好的和ＴａｑＤＮＡ聚合酶基因结合，并且可以减少引物二聚体的形成。突变引物：ｆｏｒｗａｒｄ：５ＬＧＴＧＣＡＧＧＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＣＴＴＣＧＣＣｈＡＧＡＧＣＣＴＣ一３’ｒｅｖｅｒｓｅ：５ＬＧＡＧＧＣＴＣＴＴＧＧＣＧＡＡＧＴＣＧＴＡＧＡＣＣＧＣＣＴＧＣＡＣ一３’Ｔｍ＝７７．３５℃ＤｅｎａｔｕｒｅｔｈｅｐｌａｓｍｉｄａｎｄａｎｎｅａｌｔｈｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅｄｅｓｉｒｅｄＵｓｉｎｇｔｈｅｎｏｎｓｔｒａｎｄ——ｄｉｓｐｌａｃｉｎｇａｃｔｉｏｎｏｆＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｅｘｔｅｎｄａｎｄｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｔｈｅｍｕｔａｇｅｎｉｃＦｉｇｕｒｅ２－１ｓｉｔｅ－ｄｉｒｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｍｅｔｈｏｄ．§２．２．１．２Ｇ４６Ｄ＋Ｆ６６７Ｙｍｕｒａｔｉｏｎ２４第二章ＴａｑＤＮＡ聚合酶的改造突变的方法同上，在第一次突变的基础上再进行６６７位点的突变。将酶基因第６６７位点的苯丙氨酸突变为酪氨酸。突变引物：ｆｏｒｗａｒｄ：５＇－ＧＣＧＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＡＣ坠￡ＧＧＧＧＴＣＣＴＣＴＡＣＣＫ３Ｃ一３’：ｒｅｖｅｒｓｅ：５＇－ＧＣＣＧＴＡＧＡＧＧＡＣＣＣＣ鱼坠ＧＴＴＧＡＴＧＧＴＣＴＴＧＧＣＣＧＣ－３’Ｔｍ＝７８．７８℃§２．２．２ＫＩｏｎＴａｑ的制备§２．２．２．１ＫｌｏｎＴａｑ缺失突变的引物设计及ＫＩｅｎＴａｑ片段扩增ＫｌｅｎＴａｑ缺少肽链Ｎ端的２７８个氨基酸，降低酶的５’一３’端核酸外切酶活性，我们在酶基因第８２９碱基处设计上游引物，在酶基因的末端设计下游引物，并在引物的５’端分别添加上两个性内切酶ＮｃｏＩ和ＢｇｌＩＩ的酶切位点。通过ＰＣＲ反应体系以酶基因为模板对酶基因ＫｌｅｎＴａｑ基因片段进行扩增。扩增片段约为１．７ｋｂ，扩增产物放置于４℃备用。２５ｐＬ反应体系：１０ｘｂｕｆｆｅｒ２．５ｌｘＬ，２ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，０．４Ｉ＿ｔｍｏｌ／Ｌ引物，２００１．ｔｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ，１ＵＰｆｕ酶，模板５“Ｌ。反应条件为：９５℃３ｍｉｎ，９４℃２０ｓ，５５℃２０ｓ，７２。Ｃ２０ｓ，３０个循环。扩增引物：ＰＳＥ２７８—１：５’一ＧＧＡＡ￡垦』！！鱼鱼（ＮｃｏＩ）ＧＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＧＡＧＴＴＣＧＧＣＣ一３’ＰＳＥ２７８—２：５’一ＣＣＴＴ△鱼△！￡！（ＢｇｌＩＩ）ＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＴＡＴＣＡＣＴＣＣＴＴＧＧ一３’§２．２．２．２ＫＩｏｎＴａｑ片段的回收ＫｌｅｎＴａｑＤＮＡ片段用胶回收试剂盒回收。切下含ＤＮＡ的琼脂块（尽可能小），放入１．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中。按每１００ｍｇ琼脂糖加入３００肛ＬＳ１溶液的比例加入Ｓ１溶液，放置于５５。Ｃ水浴１０ｍｉｎ，每２ｍｉｎ颠倒混匀一次。若琼脂糖重量小于１００ｍｇ，用ｄｄＨ：０补充至１００ｍｇ。务必确保琼脂糖块完全溶化，高浓度的Ａｇａｒｏｓｅ胶（＞２％）及一些特殊的胶需要增加Ｓ１溶液的使用量。加入１／３Ｓ１溶液体积的异丙醇，混匀，５５。Ｃ水浴ｉｍｉｎ。（总体积此时为５００斗Ｌ）将溶化后的Ａｇａｒｏｓｅ溶液移入吸附柱，高速离心Ｉｍｉｎ，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。在吸附柱中加入４５０ｐＬＷ１溶液，静置ｉｍｉｎ后，高速离心３０ｓ。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管第二章ＴａｑＤＮＡ聚合酶的改造中。再在吸附柱中加入４５０９ＬＷ１溶液，高速离心３０ｓ。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。高速离心ｌｍｉｎ，将吸附柱放入一个干净１．５ｍｌ的离心管中，在吸附膜加入３０Ｊ－ｔＬＴ１溶液，静置ｌｍｉｎ后，高速离心ｌｍｉｎ，将回收的ＤＮＡ于１．５ｍＬ离心管贮存于－２０℃。（若室温低于２０℃，静置时间延长至５ｍｉｎ，或者在５０℃水浴静置ｌｍｉｎ，以确保ＤＮＡ完全溶解并洗脱下来。）§２．２．２．３载体和ＫＩｅｎＴａｑ片段双酶切连接ｐＳＥ３８０质粒载体多克隆位点上存在ＮｃｏＩ和ＢｇｌＩＩ的酶切位点，将载体和回收产物进行双酶切后再次胶回收后连接，构建含有ＫｌｅｎＴａｑ片段的质粒。将连接好的质粒转化到感受态细胞。３０９Ｌ酶切体系：ｌＯｘｂｕｆｆｅｒ３“Ｌ，质粒或外源片段５９Ｌ，ＮｃｏＩ及ＢｇｌＩＩ各１ｐＬ，加入ｄｄＨ。０至３０Ｉ．ｔＬ，３７℃酶切１．５ｈ后胶回收。连接：用紫外分光光度计测量，载体及ＫｌｅｎＴａｑ片段使用等摩尔量，然后加入等量的高效连接液１６。Ｃ连接２ｈ后进行转化。转化：先加入连接好的产物２０“Ｌ，冰上静置３０ｍｉｎ，然后４２℃热击４５ｓ后立即冰上放置２ｍｉｎ，加入ＮＺＹ＋培养基５００Ｉ．ｔＬ，３７℃摇床摇培４５ｍｉｎ。接着将菌液涂氨苄板，正放ｌＯｍｉｎ后倒置于３７。Ｃ恒温箱培养１６ｈ。最后挑菌验证，并保存阳性克隆菌株。§２．２．３Ｔａｑ－Ｎ的制备§２．２．３．１Ｔａｑ－Ｎ缺失突变的引物设计及Ｔａｑ—Ｎ片段扩增Ｔａｑ—Ｎ即ＴａｑＤＮＡ聚合酶Ｃ端５１０个氨基酸缺失，仅具有酶的５＇－＊３’外切酶活性。同样通过ＰＣＲ方法进行缺失突变。以酶基因作为模板，在酶基因的起点设计上游引物，第９６６位点设计下游引物，对ＴａｑＤＮＡ聚合酶的Ｎ端进行扩增。在引物的５端分别插入两个性内切酶＆胡Ｉ和ＸｂａＩ的酶切位点。然后用同样的方法进行回收、酶切、连接、转化。２５Ｉ＿ｔＬ反应体系：ｌＯｘｂｕｆｆｅｒ２．５此，２ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，０．４９ｍｏｌ／Ｌ引物，２００Ｉ＿ｕｎｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ，１ＵＰｆｕ酶，模板５９Ｌ。反应条件为：９５＂Ｃ３ｍｉｎ，９４。Ｃ２０ｓ，５５＂Ｃ２０ｓ，７２℃２０ｓ，３０个循环。扩增的片段大小为９６６ｂｐ。第二章ＴａｑＤＮＡ聚合酶的改造扩增引物：ＴａｑＮ一１：５＇－ＧＧＡＴ鱼＆业ＧＧＧＧＡＴＧＣＡＴＣＡＣＣ一３’Ｔｍ＝６３．８６℃ＴａｑＮ一２：５＇－ＣＣＴ’Ｉ’：！：￡：！Ｉ△鱼△ＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＧＡＩ’ＣＧ一３’Ｔｍ＝６８．３７℃§２．２．４酶的表达纯化§２．２．４．１ＴａｑＤＮＡ聚合酶粗纯化将５０“Ｌ菌种接于５ｍｌＬＢ液体培养基中摇培６—８ｈ，然后转接于２５０ｍＬＬＢ液体培养基中，摇培４—６ｈ后加入ＩＰＴＧ至终浓度为５０ｍｍｏｌ／Ｌ后继续培摇过夜．ｂｕｆｆｅｒＡ（５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ．ＨＣＩｐＨ８．０、ｌｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ、℃振荡１０ｍｉｎ，加入ＴｒｉｔｏｎＸ－１００至终浓度为１％。冰上超声破碎（１５０ＷＸ５ｓ×６０次）。同时加入ＤＮＡｓｅ和ＲＮＡｓｅ至终浓度５“ｇ／ｍＬ剧烈振荡隔１０ｍｉｎ振荡一次，５，０００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，取上清即酶液。在收集的酶液中加入两倍体积的饱和硫酸铵，４℃振荡１５ｍｉｎ，５，０００ｒｐｍ，４℃离心３０ｍｉｎＤＮＡ聚合酶沉淀，去上清，保留沉淀。加入ｌｍＬｂｕｆｆｅｒＡ溶解，置ｓｔｏｒｅｂｕｆｆｅｒ（５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ—ＨＣｌｐＨ８．０、５０ｍｍｏｌ／ＬＫＣＬ、０．１ｍｍｏｌ／ＬＤＴＴ、０．５ｍｍｏｌ／ＬＰＭＳＦ、５０％甘油）中透析１２ｈ，每６ｈ换§２．２．４．２ＴａｑＤＮＡ聚合酶亲和层析将５０肛Ｌ菌种接于５ｍｌＬＢ液体培养基中摇培６—８ｈ，然后转接于２５０ｍＬＬＢＢｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ，加入溶菌酶至终浓度为ｌｍｇ／ｍＬ，冰上放置接着将２５０ｍＬ菌液于５０ｍＬ离心管中５，０００ｒｐｍ离心ｌＯｍｉｎ收集菌体，每１２５ｍＬ培养物加入５ｍＬ５０ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖）悬浮，加入溶菌酶至终浓度为ｌｍｇ／ｍＬ。冰上放置１ｈ，４混匀，４＂Ｃ摇床振荡２０ｍｉｎ。５，０００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，取上清。７５。Ｃ水浴１ｈ，使Ｔａｑ于ＴａｑＥＤＴＡ、ｌｍｍｏｌ／Ｌ一次透析液。收集终产品。进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳。液体培养基中，摇培４－６ｈ后加入ＩＰＴＧ至终浓度为５０ｍｍｏｌ／Ｌ后继续培摇过夜。２５０ｍＬ菌液于５０ｍＬ离心管中５，０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ收集菌体，每１００ｍＬ培养物加入５ｍＬ１ｈ，４℃振荡１０ｍｉｎ，加入ＴｒｉｔｏｎＸ－１００至终浓度为１％，剧烈振荡混匀，４℃振荡１０ｍｉｎ，５，０００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，取上清（留样２０止菌体破碎产物），７５℃水浴１ｈ，不时振荡，５，０００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，取上清（留样２０此粗酶液）。第二章ＴａｑＤＮＡ聚合酶的改造将Ｎｉ～凝胶轻轻混匀，取ｌｍＬ至柱中，ｌｍＬｄｄＨ：０洗涤两次，用１札Ｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＮａＩ－１２Ｐ０４、３００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０）平衡柱子，将多余的Ｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ除去，将平衡好的Ｎｉ一凝胶加入到粗酶液中，于４℃轻摇１ｈ，上柱，收集的流出液重复上柱２次，收集流出液（收集每次留出液２０９Ｌ）。用ｌｍＬＷａｓｈｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＩ－１２Ｐ０４、３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑，ｐＨ８．Ｏ）洗涤（每次都使介质悬浮起来）５－１０次，直到洗出液的Ａ。。。小于Ｏ．０１。加入０．５ｍＬＥｌｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＨ２Ｐ０４、３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑），当液体流尽后关闭流液口，然后加入ｌｍＬＥｌｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ浸泡５ｍｉｎ，打开流液口收集洗脱液，重复数次洗脱，分管收集。洗脱至０Ｄ值最小为止（收集最后一次洗涤液２０肛Ｌ）。收集的酶液中加入两倍体积的饱和硫酸铵，４℃振荡１５ｍｉｎ，５，０００ｒｐｍ，４＂Ｃ离心３０ｍｉｎ使ＴａｑＤＮＡ聚合酶沉淀，去上清，保留沉淀。加入ｌｍＬ酶溶解液溶解，置于Ｔａｑｓｔｏｒｅｂｕｆｆｅｒ中透析１２ｈ，每６ｈ换一次液。收集终产品。跑ＳＤＳ—ＰＡＧＥ蛋白电泳验证酶蛋白。分别跑１、裂解液２、热变性后粗酶液３、过柱后流出液４、最后一次洗涤液５、纯化后的酶液６、商品酶７、Ｍａｒｋｅｒ§２．２．４．３酶活性验证用ＰＣＲ反应体系来验证酶活性的存在。Ｔａｑ－ＦＳ（Ｇ４６Ｄ＋Ｆ６６７Ｙｍｕｔａｔｉｏｎ）活性验证，３０此反应体系：１０ｘｂｕｆｆｅｒ３１ｘＬ，０．４１．ｔｍｏｌ／Ｌ弓Ｉ物，１ＵＴａｑ—ＦＳ，２ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，２００Ｉ，ｔｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ，５“ＬＤＮＡ模板。反应条件为：９５℃３ｍｉｎ，９４℃２０ｓ，５５。Ｃ２０ｓ，７２℃２０ｓ，３０个循环。用商品Ｔａｑ酶作为阳性对照，水作为阴性对照。ＫｌｅｎＴａｑ活性验证，２５止反应体系：ｌＯｘｂｕｆｆｅｒ２．５灿，２ｍｒｎｏＹＬＭｇＣｌ２，０．４９ｍｏｌ／Ｌ引物各，２００９ｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ，１ＵＫｌｅｎＴａｑ，模板５止。反应条件为：９５℃３ｍｉｎ，９４＂Ｃ２０ｓ，５５。Ｃ２０ｓ，７２℃２０ｓ，３０个循环。用商品Ｔａｑ酶作为阳性对照，水作为阴性对照。第二章ＴａｑＤＮＡ聚合酶的改造第三节结果§３．１扩增引物验证Ｇ４６Ｄ突变结果分别用３’端带有突变位点和不带突变位点的突变型引物和野生型引物进行扩增，来验证是否突变成功。若突变成功则只有３’端带突变位点的引物和模板匹配，可以扩增出明显产物。分别用３’端带有突变位点和不带突变位点的野生型引物和突变型引物进行扩增，用实时荧光ＰＣＲ来验证是否突变成功。若突变成功，较早就可以检测到产物的信号。因为两种引物只有一个碱基的区别，当扩增循环数增多时，不完全匹配的引物也可以扩增出产物，但是产物的量较少且出现的较晚．结果与预期的一致（图２－２，图２—３）。验证引物为：Ｓｅｎｓｅ：５＇－ＧＧＴＧＣＡＧＧＣＧＧＴＣＴＡＣＧＧ一３’（野生）５＇－ＧＧＴＧＣＡＧＧＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡ一３’Ａｎｔｉ—ｓｅｎｓｅ：５’－ＧＧＴＣＧＧＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡ一３’（突变）Ｆｉｇｕｒｅ２－２．ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｌａｎｅ１－８：Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｍｕｔａｎｔｅｄｐｒｉｍｅｒ；Ｌａｎｅ９：Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｕｎｍｕｔａｎｔｅｄｔｅｍｐｌａｔｅｗｉｍｗｉｌｄｐｒｉｍｅｒ；Ｌａｎｅ１０：Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｕｎｍｕｔａｎｔｅｄｔｅｍｐｌａｔｅｗｉｔｈｍｕｔａｎｔｅｄｐｒｉｍｅｒ．２９第二章ＴａｑＤＮＡ聚合酶的改造３２０００８箔巴２糊ＣｙｃｌｅＮｕｍｂｅｒＣｙｃｌｅＮｕｍｂｅｒＭｕｔａｔｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍｌＭｕｔａｔｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ２舢∞帅∞帅∞洲∞８箔巴２４咖８０００ＣｙｃｌｅＮｕｍｂｅｒＣｙｃｌｅＮｕｍｂｅｒＭｕｔａｔｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ３ＵｎｍｕｔａｔｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍＦｉｇｕｒｅ２－３．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ｂｌａｃｋｓｏｌｉｄｌｉｎｅｓ：ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｕｔａｔｅｄｐｒｉｍｅｒ；ｇｒａｙｄａｓｈｌｉｎｅｓ：ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｗｉｌｄｐｒｉｍｅｒ．§３．２．扩增引物验证Ｇ４６Ｄ＋Ｆ６６７Ｙ突变结果同样，分别用３’端带有突变位点和不带突变位点的野生引物和突变引物进行扩增，来验证是否突变成功．若突变成功则只有３’端带突变位点的引物和模板匹配，可以扩增出明显产物。３’端带有突变位点和不带突变位点的野生引物和突变引物进行扩增，用实时荧光ＰＣＲ进行检测。若突变成功，较早就可以检测出产物的信号，因为两种引物也是只有一个碱基的区别，当扩增循环数增多时，不完全匹配的引物也可以扩增出产物，但是产物的量较少且出现的较晚。结果与预期的一致（图２－４，图２－５）。第二章ＴａｑＤＮＡ聚合酶的改造验证引物为：Ｓｅｎｓｅ：Ａｎｔｉ—ｓｅｎｓｅ：５＇－ＴＴＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＡＧ．３’５７一ＧＣＣＧＴＡＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡ．３’５’．ＧＣＣＧＴＡＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＴ一’（野生）（突变）Ｆｉｇｕｒｅ２－４．ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｌａｎｅｌ：Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｗｉｌｄｐｒｉｍｅｒｗｉｔｈｕｎｍｕｔａｔｅｄｔｅｍｐｌａｔｅ；Ｌａｎｅ２：Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｍｕｔａｔｅｄｐｒｉｍｅｒｗｉｔｈｕｎｍｕｔａｔｅｄｐｒｉｍｅｒ．ｔｅｍｐｌａｔｅ；Ｌａｎｅ３—７：ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｍｕｔａｔｅｄＵｎｍｕｍｔｅＡｂａｃｔｅｒｉｕｍｌＵｎｍｕｔａｔｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ２ｏｆｍｕｔａｔｅｄＦｉｇｕｒｅ２－５．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ｂｌａｃｋｓｏｌｉｄｌｉｎｅｓ：ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｉｍｅｒ．ｇｒａｙｄａｓｈｌｉｎｅｓ：ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｗｉｌｄｐｒｉｍｅｒ．３１第二章ＴａｑＤＮＡ聚合酶的改造经ＰＣＲ初步验证之后，提取质粒寄给生工测序最终确定．经过生工测序后，通过软件分析，比对观察突变成功与否，第４６位氨基酸碱基ＧＧＣ突变成ＧＡＣ，第６６７位氨基酸ＴＴＣ突变成ＴＡＣ（图２－６，图２—７）。舞渣毽Ｇ鹪镶瞩鞠霪薅黼Ｇ毹嘲罐瞄娜餐麟Ｇ箧黛嘲罐Ｇ篷奠茎驾螯Ｇ缉Ｆｉｇｕｒｅ２－６Ｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｏｒｔｙ－ｓｉｘｔｈａｍｉｎｏａｃｉｄｏｆＴａｑＥ．Ｆｉｇｕｒｅ２－７Ｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｏｒｔｙ－ｓｉｘｔｈａｍｉｎｏａｃｉｄｏｆＴａｑＥ．篆溺躺慧一熏ｍＬ２３４＊鼍鼍＊＊鼍＊＊＊＊＊鼍＊鼍鼍＊鼍＊辛ｌ鼍鼍＊＊＊＊＊＊＊＊＊差＊＊＊鼍＊＊＊＊＊＊§３．３双酶切验证ＫＩｅｎＴａｑ的制备结果转化后挑取单菌落，接入５ＬＢ液体培养基中，摇到平台期后，提取质粒双酶切验证，电泳结果如下可以看出所挑的４个菌都是连接正确的。酶切产物约为１．７ｋｂ（图２—８）。５４．５ｋｂ１．７ｋｂＦｉｇｕｒｅ２－８ＴｈｅｍａｐｏｆＫｌｅｎｔａｑ’Ｓｐｌａｓｍｉｄｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｅｎｚｙｍｅ．§３．４双酶切验证Ｔａｑ－Ｎ的制备结果转化后挑取单菌落，接入５ｍＬＬＢ液体培养基中，摇到平台期后，提取质粒双酶切验证，制作成功的酶经过双酶切后，应该得到片段大小分别为４．５ｋｂ和９６６ｂｐ的产物带，所挑的４个菌都是连接正确的，结果与预期的一３２第二章ＴａｑＤＮＡ聚合酶的改造致（图２－９）。Ｉ２３４５４．５ｋｂ９６６ｂｐＦｉｇｕｒｅ２－９ＴｈｅｍａｐｏｆＴａｑ－Ｎ’Ｓｐｌａｓｍｉｄｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｅｎｚｙｍｅ．§３．５酶纯化和活性验证§３．５．１纯化§３．５．１．１粗纯化同样从２５０ｍＬ菌液中提取酶，通过热变性、盐析将酶进行粗纯化．提取的酶液进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ蛋白电泳，如图２一１０所示，结果出现９４．０ＫＤ目的条带。ｌ２３１１６ＫＤ——６６．２ＫＤ～一４５．０ＫＤ…一９４·ＯＫＤ一～３５．０ＫＤ一一一２５．０ＫＤ１８．４ＫＤ一一１４．４ＫＤ一…Ｆｉｇｕｒｅ２－１０．ＳＤＳ—ＰＡＧＥｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＴａｑＥ．ＬａｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＴａｑＤＮＡｐｏｌ；Ｌａｎｅ３：ｐｕｒｉｆｉｅｄＴａｑＤＮＡｐ０１．１：ｍａｒｋｅｒ．Ｌａｎｅ２：Ｅ．ｃｏｌｉ§３．５．１．２亲和层析将纯化过程中收集的各种产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳。如图２—１１所示，经过３３第二章ＴａｑＤＮＡ聚合酶的改造溶菌酶作用，离心后上清电泳可以见到许多宿主菌自身的杂蛋白条带（泳道１）。经过７５℃１ｈ热变性后，去除了大部分的杂蛋白（泳道２）。热变性后的产物进行ｊ堂住纯化，为了保证镍颗粒完全结合酶蛋白，反复多次过柱，并将最后一次收集到的流出液电泳，没有蛋白质条带出现，可见蛋白结合完全（泳道３）。最后Ｅｌｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ反复多次洗脱，收集最后一次流出液进行电泳，也未见蛋白质条带，说明已经洗脱完全（泳道４）。最后透析得到的酶液进行电泳可见明显的９４．０ＫＤ的目的条带（泳道５）。与商品酶纯化效果进行对比，可见纯化效果较好，仅在３２．０ＫＤ附近多了一条较浅的杂蛋白条带。ｌ２３４５６７．．．．——Ｉ１６．０ＫＤ．．．．．．６６．２ＫＤ——４５．０ＫＤ——３５．０ＫＤ２５．０ＫＤ——１８．４ＫＤＦｉｇｕｒｅ２－１１．ＳＤＳ－ＰＡＧＥｏｆｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｔｅｐｓｏｆＴａｑ－ＦＳｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｅｎｚｙｍｅ．１ａｎｅ１，ｃｅｌｌｌｙｓａｔｅｃｌｅａｒｅｄｂｙｂｒｅａｋｉｎｇｕｐｗｉｔｈｂａｃｔｅｒｉｏｌｙｓｉｓ；ｌａｎｅ２，ｃｅｌｌｌｙｓａｔｅｃｌｅａｒｅｄｂｙｔｈｅｒｍａｌｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ；ｌａｎｅ３，ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈｌｉｑｕｉｄｂｙｂｉｎｄｉｎｇｗａｓｈｉｎｇｂｕｆｆｅｒ；ｌａｎｅ４，ｆｌｏｗ—ｔｈｒｏｕｇｈｌｉｑｕｉｄｂｙｂｕｆｆｅｒ；ｌａｎｅ５，ｆｉｎａｌｌｙｐｕｒｌｅｄＴａｑ－ＦＳ；ｌａｎｅ６，ＴａｑＥｂｕｙｅｄｆｒｏｍＳａｎｇｏｎ；ｌａｎｅ７，ｍａｒｋ．§３．５．２活性验证§３．５．２．１Ｔａｑ－ＦＳ酶活性验证纯化后通过普通ＰＣＲ体系，把纯化的Ｔａｑ—ＦＳ与普通的商品Ｔａｑ酶对照。ＰＣＲ扩增后电泳观察有产物，与商品Ｔａｑ酶所扩增的产物大小一致，说明改造后Ｔａｑ—ＦＳ具有活性。结果如图２—１２所示：第二章ＴａｑＤＮＡ聚合酶的改造１２３４５６７８Ｆｉｇｕｒｅ２－１２．ＴｈｅｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＴａｑ－ＦＳｂｙＰＣＲ：Ｌａｎｅ１－６：ｐｒｏｄｕｃｔｏｆＴａｑ·ＦＳ，Ｌａｎｅ７：ｐｒｏｄｕｃｔｏｆＴａｑＥ，Ｌａｎｅ８：ｍａｒｋｅｒ．§３．５．２．２ＫＩｅｎＴａｑ活性验证纯化后通过普通ＰＣＲ体系，把纯化的ＫＩｅｎＴａｑ酶与普通的商品Ｔａｑ酶对照。ＰＣＲ扩增后电泳观察有产物，与商品Ｔａｑ酶所扩增的产物大小一致，证明改造后酶具有活性。结果如图示：２３４５６７Ｆｉｇｕｒｅ２－１３．ＰＣＲｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＫｌｅｎＴａｑ．Ｌａｎｅｌ：ｍａｒｋｅｒ，Ｌａｎｅ２－４、６－７：ｐｒｏｄｕｃｔｏｆＫｌｅｎｔａｑ，Ｌａｎｅ５ｐｒｏｄｕｃｔｏｆＴａｑＥ．第四节讨论应用基因工程技术对ＴａｑＤＮＡ聚合酶进行了定点突变和缺失突变，并获得了目的蛋白。在实验过程中，设计包含突变位点的突变引物对环状的质粒进行扩增，对酶基因进行定点突变。整个突变过程只需要１次ＰＣＲ反应、１次ＤｐｎＩ酶解和１次转化，即完成了定点突变，无需对ＰＣＲ产物进行末端处理，也无需进行亚克隆等，减少了传统定点突变的工作量，而突变成功率较高。第二章ＴａｑＤＮＡ聚合酶的改造突变的技术要点：（１）准备突变的质粒必须是甲基化且是闭合环状的。（２）引物是一对包含突变位点的互补的（正、反向）核苷酸链，而且要比一般的ＰＣＲ弓Ｉ物（１８ｂｐ＇～２１ｂｐ）长，一般为２５—４５ｂｐ，因为引物中含有突变位点，和模板不能完全匹配。所以尽量使得退火温度≥７８０Ｃ．使得引物可以很好的和ＴａｑＤＮＡ聚合酶基因结合，并且可以减少引物二聚体的形成。（３）须要高保真的ＤＮＡ聚合酶避免在ＰＣＲ反应中出现错配而导致基因突变。（４）ＰＣＲ产物要用内切酶ＤｐｎＩ充分酶切消化，以提高突变检出率。（５）ＰＣＲ延伸步骤时间要充足。（６）高保真ＰｆｕＤＮＡ聚合酶酶量要充足。因ＰｆｕＤＮＡ聚合酶扩增速率较慢，扩增的是整个质粒，故所需的总时间比一般的ＰＣＲ时间要长很多，适当增加酶量以补充长时间高温下的酶活力损失。而进行缺失突变，首先要在保证模板准确的前提下，以尽量少的循环数扩增所要的缺失片段，而不是尽量多的循环，以减少扩增过程中由于错配而发生的基因突变。在进行蛋白改造的过程中，要弄清表达载体中，与核糖体１６ＳｒＲＮＡ结合的序列即ＳＤ序列（Ｓｈｉｎｅ—Ｄａｌｇａｒｎｏｓｅｑｕｅｎｃｅ）所在位置。ＳＤ序列在蛋白质表达形成起始复合物过程中起到非常重要的作用ｎ｝Ｈ３。一般序列中心碱基与起始密码子ＡＴＧ距离为５—１３ｂｐ，在大肠杆菌基因中，最佳的距离为８一１０个ｂｐＨ８、１９３。所以在蛋白质改造时，要注意ＳＤ序列所在的位置以及其与起始密码子的距离，否则就容易造成表达效率不高甚至整个基因表达的移码突变，导致蛋白质失活。ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有良好的热稳定性，在９７℃时的半衰期为５－６分钟。所以ＴａｑＤＮＡ聚合酶在纯化时相对其他的蛋白酶来说具有优越性，可以简单的通过破碎菌体、７０℃高温变性１ｈ、离心收集上清得到分离纯化。通过这种方法制备的酶已经能很好的满足一般ＰＣＲ或者实时ＰＣＲ。而制备酶的抗体则必须要有高纯度的蛋白。从纯化的效果上看，亲和层析得到的酶纯度更高，所以我们在酶的Ｎ端连上了６个Ｈｉｓ用于亲和层析，得到了较高纯度的酶。这种纯化方法快速简单，但是在ＳＤＳ—ＰＡＧＥ蛋白电泳时可以看见纯化后的酶仍然具有杂带，可能是宿主菌内存在某些蛋白可以耐受高温没有完全变性。如何彻底消除杂带还需要进一步的实验。第二章ＴａｑＤＮＡ聚合酶的改造参考文献【１】ＨｏｒｔｏｎＳＮ，ＨｕｎｔＨＤ．Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｂｙｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎｕｓｉｎｇｔｈｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ［Ｊ】．Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：５１—５９．【２】Ｃｈａｎｇｓｗ，ＳｈｉｅｈＣＪ．ＭｕｌｔｉｐｌｅｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｐｔｉｍｕｍｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＬＩＰ１ｏｆｔｈｅＣａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａＬＩＰ１ｇｅｎｅａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ【Ｊ】．ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００４，１８６（１）：１５９－２６４．ｏｆｌｈｅｃｒｉｔｉｃａｌｂａｓｅｓ［３】Ｒ＿ｈｅｉｎａｌｈＭ．ＪｏｎｅｓＲ．ＭｕｔａｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｔｈｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＥｎｖｉｒＡｒｅＲ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ５４－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｍｏｔｅｒｉｎａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｓｔｒａｉｎＡＤＰ１［Ｊ］．ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００３，６９：５６２７．５６３５．［４】ＨｕａｎｇＣＹ，ＣｈａｎｇＡＫ．Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆｔｈｅｉｏｎｉｚａｂｌｅｇｒｏｕｐｉｎｔｈｅａｃｔｉｖｅｓｉｔｅｏｎｏｆｚｙｒａｏｍｏｎａｍｏｂｉｌｉｓｐｙｒｕｖａｔｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ：ＥｆｅｃｔＥｕｒＪａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｐＨｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ［Ｊ】．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００１，２６８（１２）：３５５８－３５６５．ＫＢ．ＰｒｏｔｅｉｎｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＢａｍＨ１ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ：【５】ＭｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙＰ，ＲｏｙＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ９３１．９４５．ｏｆＣｙｓ５４ｂｙＡｌａａｌｈａｎｃｅｃａｔａｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ】．ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ，１９９８，１１（１０）：［６】ＳａｒｋａｒＧＳｏｍｍｅｒＢｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１ＳＳ．Ｔｈｅｍｅｇａｐｒｉｒｎｅｒｍｅｔｈｏｄｏｆｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａ—ｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ】．９９０，８（４）：４０４－４０７。ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ【７］ＣｏｌｏｓｉｍｏＡ，ＸｕＺ，Ｎｏｖｅｌｌｉ１３Ｉｅｔａ１．ＳｉｍｐｌｅｖｅｒｓｉｏｎｏｆｍｅｇａｐｒｉｍｅｒＰＣＲｆｏｒｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ［Ｊ】。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９９，２６：８７０—８７３。【８】李振林；夏虎；刘克荣．在分子克隆中用ＰＣＲ进行定点突变【Ｊ】．第一军医大学分校学报，２００２，２５（２）：８６．８８．［９】王易伦；张平武；戴建新．非连续多核苷酸定点突变的方法【Ｊ】．生物工程学报，１９９６，１２（增刊）：１４６．１５１．【１０】丰岩清；国宁．运用ＵＳＥ定点诱变技术制备ｗｉｌｓｏｎ病突变体【Ｊ】．中山大学学报（医学科学版），２００３，２４（６）：５２．５６．［１１］ＵｒｂａｎＡ，ＮｅｕｋｉｒｃｈｅｎＳ，Ｊａｅｇｅｒｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｕｓｉｎｇ２２２７．２２２８．ｏｎｅＫＥ．ＡｒａｐｉｄａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄＡｃｉｄｓｆｏｒｓｉｔｅ．ｄｉｒｅｃｔｅｄｓｔｅｐｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎＰＣＲ［Ｊ】．ＮｕｃｌｅｉｃＲｅｓ，１９９７，２５（１１）：３７第二章ＴａｑＤＮＡ聚合酶的改造【１２】ＷａｒｒｅｎｓＡＮ，ＪｏｎｅｓＭＤ，ＬｃｃｈｌｃｒＲＩ．ＳｐｌｉｃｉｎｇｂｙｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎｂｙＰＣＲｕｓｉｎｇａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ａｎｉｍｐｒｏｖｅｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｔｈｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｈｙｂｒｉｄｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｔｅｒｅｓｔ【Ｊ】．Ｇｅｎｅ，１９９７，１８６（１）：２９－３５．【１３】ＨｏｒｔｏｎＲＭ，ＣａｉＺＬ，ＨｏｒｔｏｎＳＮ．Ｇｅｎｅｓｐｌｉｃｉｎｇｂｙｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：Ｔａｉｌｏｒ－ｍａｄｅｇｅｎｅｓｕｓｉｎｇｔｈｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ【Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈ·ｎｉｑｕｅｓ，１９９０，８（５）：５２８—５３５．【１４】ＫｅＳＨ．ＭａｄｉｓｏｎＥＬ．Ｒａｐｉｄａｎｄｅｔｌｉｃｉｅｎｔｓｉｔｅ—ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｂｙｓｉｎｇｌｅ—ｔｕｂｅｍｅｇａｐｒｉｍｅｒＰＣＲｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９７，２５：３３７１—３３７２．【１５】ｄｅＳｍｉｔ，Ｍ．Ｈ．，ａｎｄＪ．ＶａｎＤｕｉｎ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｉｎｉｔｉａｔｉｏｎａｔｔｈｅｃｏａｔ－ｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅｏｆｐｈａｇｅＭＳ２：ｎａｔｉｖｅｕｐｓｔｒｅａｍＲＮＡｒｅｌｉｅｖｅｓｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｂｙｌｏｃａｌｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ［Ｊ】．Ｍ０１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９３，９：１０７９－１０８８．［１６】Ｈｕｉ，Ａ．，ａｎｄＨ．Ａ．ｄｅＢｏｅｒ．．Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄｒｉｂｏｓｏｍｅｓｙｓｔｅｍ：ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｏｆａｓｉｎｇｌｅｍＲＮＡｓｐｅｃｉｅｓｂｙａｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｍｕｔａｔｅｄｒｉｂｏｓｏｍｅｓｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｉｌ［Ｊ】－Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８７，８４：４７６２－４７６６．［１７】Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．，ａｎｄＬ．Ｄａｌｇａｍｏ．．ＴｈｅＴ－ｔｅｒｍｉｎａｌｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ１６ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｔｏｎｏｎｓｅｎｓｅｔｒｉｐｌｅｔｓａｎｄｒｉｂｏｓｏｍｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，１９７４，７１：１３４２－１３４６．［１８】Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｍ．Ｂｊｅｒｋｎｅｓ，Ｒ．Ｋｕｍａｒ，ａｎｄＥ．Ｊａｙ．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｏｐｔｉｍａｌａｌｉｇｎｅｄｓｐａｃｉｎｇｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅＳｈｉｎｅ－ＤａｌｇａｍｏｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｔｈｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｃｏｄｏｎｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｍＲＮＡｓ［Ｊ】．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９４，２２：４９５３－４９５７．［１９】Ｒｉｎｇｑｕｉｓｔ，Ｓ．，Ｓ．Ｓｈｉｎｅｄｌｉｎｇ，Ｄ．Ｂａｒｒｉｃｋ，Ｌ．Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｂｉｎｋｌｅｙ，ＧＤ．Ｓｔｏｒｍｏ，ａｎｄＬ．Ｇｏｌｄ．ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ：ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｉｔｈｉｎｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍｅ—ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ［Ｊ】．Ｍ０１．Ｍｉｃｒｏｂｉ０１．１９９２，６：１２１９－１２２９．３８第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用第一节引言§１．１在探针检测的实时ＰＣＲ体系中的应用ＰＣＲ技术得到了不断的发展。近年，实时ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ）技术实现了ＰＣＲ从定性到定量的飞跃，其以特异性强、灵敏度高、自动化、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，成为分子生物学和分子诊断的重要技术平台，并广泛应用于遗传病、病原体和肿瘤等方面的检测和诊断。在基因定量、基因分型和ＳＮＰｓ检测等方面正得到越来越广泛的应用ｎ１。在用于ＤＮＡ多态性基因分型时，往往需要应用到探针。目前基于实时ＰＣＲ的各种标记探针技术主要包括ＴａｑＭａｎ探针乜３，ＦＲＥＴ探针口１，分子信标探针Ｈ１及新型荧光双链置换探针啼＿６｜。在这些探针中，荧光双链置换探针具有非常好的识别单碱基突变的能力，而且其特异性可以通过调节探针的长度和两条链相差的碱基数来实现，具有很强的特异性和灵敏度，适用于基因分型。但是有时会出现在ＰＣＲ循环的开始就检测到探针的荧光信号，而看不Ｎｓ型信号升起，影响到结果的判读。考虑是由于标记在探针５’端的荧光基团被ＴａｑＤＮＡ聚合酶酶切，所以我们尝试用消除了５’－÷３Ｉ夕｜、切酶活性的ＴａｑＤＮＡ聚合酶来解决上述问题。§１．２在ＰＡＰ技术中的应用随着研究的不断深入，对稀有突变检测有许多的方法，如单链构象多态性（ＳＳＣＰ）‘６ｌ、异源双链技术（ＨＡ）口３、变性的高效液相色谱法（ＤＨＰＬＣ）咖、变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）‘９｜、化学错配裂解法（ＣＭＣ）ｎ们、质谱法Ⅱ妇以及ＤＮＡ芯片技术ｎ２３和焦磷酸水解激活的聚合酶反应（ＰＡＰ）技术ｎ３３等。ＳＳＣＰ技术是出现最早、应用较广，该实验方法具有简便易行，成本较低，但是为了确保突变检测率，它最适宜的检测长度约为１００＂－３００ｂｐｎ４Ｊ。ＨＡ技术是基于双链构像多态来分离不同ＤＮＡ片断ｎ５｜。但是随着ＰＣＲ产物片段长度的增加，突变对它们在电泳中迁移率改变的影响也逐渐减小，因此仅对３００ｂｐ内ＤＮＡ的突变检测效果较好，从而了该法的应用范围。ＤＨＰＬＣ技术利用在合适的温度条件下，纯合双链和杂合双链解链程度的差异而导致不同的电荷分布，使它们和３９第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用层析柱的结合能力产生差异，分别在不同的洗脱条件下被洗脱ｎ６３具有高效、简便、省时、无放射污染的优点，但是也主要用来检钡，ＪＪ２００—３００ｂｐ大小的ＤＮＡ片段。ＤＧＧＥ技术是利用由碱基序列所决定的ＤＮＡ片段溶解度的差异，这种差异导致了电泳分离中泳动率的变异，从而达到分离野生型和突变型片段的目的。具有快速易行的优点，但是当突变发生在高熔点区时则难以利用ＤＧＧＥ技术检测。ＣＭＣ技术则是用碳化二亚胺修饰错配碱基，再用同位素标记的引物进行ＰＣＲ反应，Ｔａｑ酶将于被修饰碱基处终止延伸，之后经放射自显影可检测到缩短的ＰＣＲ产物。化学错配裂解法的最大优点是能对长至２ｋｂ的片段进行分析，并能确定突变位置，但是步骤多，费时，且需接触有毒的化学物质。而质谱法对突变进行检测的时候对质量的灵敏度特别高，很容易将仅含有一个不同碱基的两段基因序列区别开，但是对分析样品的分离纯化程度要求很高，一次只能分析一个样品，不易于自动化而且费用较高。ＤＮＡ芯片技术是利用荧光标记的正常ＤＮＡ和突变ＤＮＡ分别与两块ＤＮＡ芯片杂交，由于存在一个碱基的差异，正常ＤＮＡ矛Ｉ］突变ＤＮＡ将会得到不同的杂交图谱，通过共聚焦显微镜分别检测两种ＤＮＡ分子产生的荧光信号即可确定是否存在突变ｎ７１。该方法具有简单、迅速、自动化程度高的优点，但其最大的缺点在于当检测的位点多时，其假阳性可高达４０％。焦磷酸水解激活的聚合酶反应技术是目前对稀有突变检测最有效的技术之一。ＤＮＡ聚合酶不仅有聚合活性，还有焦磷酸酶活性。聚合酶活性使得在ＰＣＲ反应中有ｄＮＴＰ—ｄＮＭＰ＋ＰＰｉ反应；焦磷酸酶活性有ｄＮＭＰ＋ＰＰｉ—ｄＮＴＰ反应。设计一段末端用ｄｄＮＭＰ封闭的引物，只有当引物的３’端完全和模板ＤＮＡ序列配对的时候，才可以发生焦磷酸酶反应即ｄｄＮＭＰ＋ＰＰｉ—ｄｄＮＴＰ，从而使得末端的ｄｄＮＭＰ脱落下来，封闭被解除，引物得以延伸。而如果引物与模板不匹配则无法发生焦磷酸酶反应，则引物由于３’端被封闭而无法延伸，这样就可以将一个核苷酸的区别识别开来。由于ＴａｑＤＮＡ聚合酶对ｄｄＮＴＰ具有抵抗作用，所以我们将改造后的ＴａｑＤＮＡ聚合酶应用到该检测体系中，得到了较好的检测效果。§１．３酶抗体的应用实现热启动ＰＣＲ如前所述，ＴａｑＤＮＡ聚合酶在ＰＣＲ反应中，在２０℃一３７℃下仍有一定的聚合酶活性。因此在ＰＣＲ反应开始之前，当引物与模板之间发生非特异复性时，聚合酶就在其３’端聚合了几个碱基并稳定了这种非特异复性引物，产生非特异第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用性的扩增以及产生引物二聚体。这对ＰＣＲ反应是不利的。所以人们希望提高ＴａｑＤＮＡ聚合酶的最适反应温度以最大程度的降低这种不利反应。目前可以通过很多途径来提高ＴａｑＤＮＡ聚合酶的最适反应温度，达到热启动的目的。如对酶进行物理隔绝法ｎ８。２２ｌ、化学修饰法妲３Ｉ、设计特殊的引物乜４‘２６３或者用基因工程的方法对酶进行缺失突变和定点突变口７１。但是这些方法容易导致ＤＮＡ的脱嘌呤和断裂汹汨３、影响酶的续进性和忠实性口¨２１而且方法比较繁琐和昂贵，我们则尝试使用抗体，形成抗原抗体复合物，使得酶在较高的温度下才得以释放发挥活性。第二节材料与方法§２．１．材料ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ、ｄｄＮＴＰｓ、（上海Ｓａｎｇｏｎ公司产品）：ＴａｑＨＳ（大连宝生物工程有限公司）；Ｔａｑ—ＦＳ、ＫｌｅｎＴａｑ、Ｔａｑ—Ｎ均由本实验室制备；扩增引物、置换探针、测序引物（上海Ｓａｎｇｏｎ公司合成）；人类基因组模板和Ｋ—ｒａｓ突变型质粒模板、ｐＳＥ３８０、ＤＨＳａ、ＢＬ２１（本实验室保存）；镍凝胶（ＧＥ）；ＰｒｏｔｅｉｎＧ纯化试剂盒（Ｐｉｅｒｃｅ）；其它化学试剂均为国产分析纯。§２．２．主要实验仪器Ｔ３Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ公司），Ｍｘ３０００Ｐ实时荧光ＰＣＲ仪（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），紫外分光光度计等。§２．３方法§２．３．１在探针检测的实时ＰＣＲ体系中的应用§２．３．１．１置换探针验证Ｔａｑ－ＦＳ５’－－，３’外切酶活性的降低２５９Ｌ反应体系为：ｌＯＩＵＸｂｕｆｆｅｒ２．５１１Ｌ，２ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，０．２９Ｊｎｏｌ／Ｌ探针，１５ｓ，５５℃２０ｓ，７２＂ＣＴａｑ—ＦＳ。反应条件为：９５℃３ｍｉｎ，９５。Ｃ２０ｓ，４０个循环。与未改造的ＴａｑＤＮＡ聚合酶进行对照。§２．３．１．２置换探针验证ＫＩｅｎＴａｑ５·－－，３’外切酶活性的降低２５１．ＬＬ反应体系为：１０Ｘｂｕｆｆｅｒ２．５９Ｌ，２ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，０．２９ｍｏｌ／Ｌ探针，０．４ｐＪｎｏｌ／Ｌ引物各，２００“ｍ０１／ＬｄＮＴＰｓ，１ＵＫｌｅｎＴａｑ，模板５“Ｌ。反应条件为：９５℃３ｍｉｎ，９５℃１５ｓ，５５℃２０ｓ，７２℃２０ｓ，６０个循环。与未改造的ＴａｑＤＮＡ聚合酶进行对照。４１第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用§２．３．１．３置换探针验证Ｔａｑ－Ｎ的５’＿３’外切酶活性２５｝ｔＬ反应体系为：ＩＯＸｂｕｆｆｅｒ２．５ｐＬ，２ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，０．２９Ｊｎｏｌ／Ｌ探２０ｓ，７２℃２０ｓ，４０针，ＩＵＴａｑ—Ｎ。反应条件：９５℃３ｍｉｎ，９５。Ｃ１５ｓ，５５。Ｃ个循环。未改造的ＴａｑＤＮＡ聚合酶作为阳性对照，水作为阴性对照。§２．３．２在ＰＡｌ：＇技术中的应用§２．３．２．１引物的设计利用ＰＡＰ技术对大肠癌Ｋ－ｒａｓ基因第十二位密码子第一和第二个核苷酸的突变进行检测。该技术所用的引物为末端封闭ｄｄＮＭＰ的引物，我们根据大肠癌Ｋ－ｒａｓ基因第十二位密码子相应序列设计突变型引物（表２—１）。Ｔａｂｌｅ２－１－ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅｍｕｔａｎｔｅｄｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒＫ－ｒａｓｍｕｔａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎＦ－Ｐｒｉｍｅｒ１２—１一Ａ１２一ｌ－ｃ１２－Ｉ－Ｔ５’一ＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡ从ＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴｄｄＨ＿３’５’－ＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡ从ＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴｄｄ猢’５’一ＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡ从ＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧｃＴ甜ｒ－３’Ｒ－Ｐｒｉｍｅｒ１２－ｌ－Ａ１２－１－Ｃ１２—１一Ｔ５’－ＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣ甜阳’５’一ＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣａＩ彬－３’５’一ＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣｄｄＡ－３’Ｆ－Ｐｒｉｍｅｒ１２－２－Ａ１２－２－Ｃ１２－２－Ｔ５’一ＴＧＡＣＴＧ从ＴＡＴＡＡＡＣ竹ＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧｄｏＭ－３’５’一ＴＧＡＣＴＧ从ＴＡＴ从ＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧｃＴＧ删’５’一从ＧＧｃＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡｃＧＣＣＡｄｄＧ－３’５’一从ＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡｄｄＡ－３’Ｒ－Ｐｒｉｍｅｒ１２—２—Ａ１２－２－Ｃ１２－２一Ｔ５’一ＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡ从ＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧｄｄＨ’５’一从ＧＧｃＡｃＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡｄｄ心’§２．３．２．２考察其耐受性将ＴａｑＦＳ用于ＰＡＰ技术用于对大肠癌Ｋ－ｒａｓ基因第十二位密码子第一和第二个核苷酸的突变进行检测。首先考察该检测方法的耐受性。用Ｋ－ｒａｓ突变型引物分别扩增５００ｎｇ、５０ｎｇ、５ｎｇ、０．５ｎｇ的野生型基因组模板。２５“Ｌ反应体系：２０ｍｍｏｌ／ＬＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ６．９），ｌＯｍｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ４）ｚＳ０４，５０ｍｍｏｌ／ＬＫＣＩ，ｉ．５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，２５ｐｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ，０．１¨ｍｏｌ／Ｌ引物，９０“ｍｏｌ／ＬＮａ４ＰＰｉ，２％ＤＭＳＯ，ＩＵＴａｑ—ＦＳ，１％Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ，Ｘｔｅｍｐｌａｔｅ。４２第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用反应条件为９５℃１５ｓ，６０＂Ｃ２０ｓ，６４＂Ｃ２０ｓ，６８℃３０ｓ，７２℃３０ｓ。８０个循环。用Ｋ－ｒａｓ突变型引物扩增突变型质粒模板作为阳性对照。§２．３．２．３考察其灵敏度其次考察该检测方法的灵敏度。用Ｋ－ｒａｓ突变型引物分别扩增５０００ｃｏｐｉｅｓ、５００ｃｏｐｉｅｓ、５０ｃｏｐｉｅｓ、５ｃｏｐｉｅｓ、０．５ｃｏｐｉｅｓ相应的突变型质粒模板。２５¨Ｌ反应体系：２０ｍｍｏｌ／ＬＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ６．９），ｌＯｍｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ４）。Ｓ０４，５０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ，１．５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，２５¨ｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ，０．１９ｍｏｌ／Ｌ引物，９０９ｍｏｌ／ＬＮａ４ＰＰｉ，２％ＤＭＳＯ，１ＵＴａｑ—ＦＳ，１％Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ，Ｘｔｅｍｐｌａｔｅ。反应条件为９５＂Ｃ１５ｓ，６０℃２０ｓ，６４℃２０ｓ，６８℃３０ｓ，７２℃３０ｓ。８０个循环。§２．３．２．４考察其特异性最后考察该检测方法的特异性。用Ｋ－ｒａｓ突变型引物分别扩增５ｃｏｐｉｅｓ突变型质粒＋４００ｎｇ基因组ＤＮＡ、５ｃｏｐｉｅｓ突变型质粒＋２００ｎｇ基因组ＤＮＡ、５ｃｏｐｉｅｓ突变型质粒＋ｌＯＯｎｇ基因组ＤＮＡ、５ｃｏｐｉｅｓ突变型质粒＋５０ｎｇ基因组ＤＮＡ、５ｃｏｐｉｅｓ突变型质粒＋５ｎｇ基因组ＤＮＡ、５ｃｏｐｉｅｓ突变型质粒＋Ｏ．５ｎｇ基因组ＤＮＡ、５ｃｏｐｉｅｓ突变型质粒＋０基因组ＤＮＡ。２５“Ｌ反应体系：２０ｍｍｏｌ／ＬＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ６．９），ｌＯｍｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ４）。Ｓ０４，５０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ，１．５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，２５｝ｌｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ，０．１“ｍｏｌ／Ｌ引物，９０９ｍｏｌ／ＬＮａ４ＰＰｉ，２％ＤＭＳＯ，１ＵＴａｑ—ＦＳ，１％Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ，Ｘｔｅｍｐｌａｔｅ。反应条件为９５＂（２环。１５ｓ，６０。Ｃ２０ｓ，６４℃２０ｓ，６８。Ｃ３０ｓ，７２。Ｃ３０ｓ。８０个循§２．３．３酶抗体的应用实现热启动ＰＣＲ§２．３．３．１抗原纯化２００ｍＬ菌液于５０ｍＬ离心管中５，０００ｒｐｍ离心ｌＯｍｉｎ收集菌体，每１００ｍＬ培养物加入５ｍＬＢｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ。加入溶菌酶至终浓度为ｌｍｇ／ｍＬ，冰上放置１ｈ。４℃振荡ｌＯｍｉｎ。加入ＴｒｉｔｏｎＸ－１００至终浓度为１％，剧烈振荡混匀，４℃振荡１０ｍｉｎ。５，０００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，取上清。７５。Ｃ水浴１ｈ，不时振荡。５，０００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，取上清。将Ｎｉ－凝胶轻轻混匀，取１ＩＩｌＬ至柱中。ｌｍＬｄｄＨ：０洗涤两次。用ｌｍＬＢｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）平衡柱子。将多余的Ｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ４３第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用除去。将平衡好的Ｎｉ－凝胶加入到粗酶液中，于４。Ｃ轻摇１ｈ。上柱，收集的流出液重复上柱２次，收集流出液。用ＩｍＬＷａｓｈｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）洗涤（每次都使介质悬浮起来）５一ｉ０次，直到洗出液的ｏＤ渤小于０．Ｏｌ。加入０．５ｍＬＥｌｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ，当液体流尽后关闭流液口，然后加入ｉｍＬＥｌｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ浸泡５ｍｉｎ，打开流液口收集洗脱液。重复数次洗脱，分管收集。洗脱至ＯＤ。。。值最小为止。收集的酶液中加入两倍体积的饱和硫酸铵，４℃振荡１５ｍｉｎ。５，０００ｒｐｍ，４。Ｃ离心３０ｍｉｎ使酶沉淀。去上清，保留沉淀。加入１ＩＩｌＬ酶溶解液溶解，置于Ｔａｑｓｔｏｒｅｂｕｆｆｅｒ中透析１２ｈ，每６ｈ换一次液。收集终产品。§２．３．３．２抗备§２．３．３．２．１抗原加入佐剂后免疫兔子将上述纯化制备的Ｔａｑ－ＦＳ作为抗原，以每次０．２ｍｇ／次的计量分别免疫三只家兔。首先于家兔双后足掌皮下注射弗氏完全佐剂进行初次免疫，２周后于背部和胯关节多点注射抗原佐剂复合物，每隔２周进行１次。§２．３．３．２．２抗原板的包被用包被缓冲液将抗原稀释至５－１０９９／ｍＬ包被抗原板，在抗原板上，每个孔加入１００肛Ｌ的抗原，４。Ｃ过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗３次，每次３分钟。然后加入ＢＳＡ封闭，于４℃保存备用。§２．３．３．２．３ＥＬＩｓ＾法检测抗体滴度分别在免疫后第８周、第１０周取０．５ｍＬ左右兔子血液，３７℃静置１ｈ后，１２，０００ｒｐｍ，离心１５ｍｉｎ，取上清做ＥＬＩＳＡ实验，实验中二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗兔ＩｇＧ。血清稀释，第一个梯度为２００倍稀释，以后以１０倍递减。稀释液为血清稀释液。每只兔子做两个平行排。然后取已经包被好的抗原板，每个孔加入ｌＯＯｇＬ不同梯度稀释的血清３７。Ｃ孵育３０ｍｉｎ。反复洗涤５次。于反应孔中加入新鲜稀释２０，０００倍的酶标第二抗体，山羊抗兔ＩｇＧ，１５０ｐＬ，３７。Ｃ孵育３０ｍｉｎ。反复洗涤５次，最后一次用ｄｄＨ。０洗涤。然后加底物液ＴＭＢ显色，于各个反应孔中加入临时配置的底物溶液０．ｉｍＬ，３７４Ｃ１５ｍｉｎ。最后于各反应孔中加入２ｍｏｌ／Ｌ硫酸０．０５ｍＬ终止反应。测０Ｄ。。。值。§２．３．３．２．４抗体ＩｇＧ的纯化第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用在得到的血清中，含有很多其他的杂蛋白，在应用前必须先对其进行纯化。首先室温下，在含抗Ｔａｑ－ＦＳ抗体的血清中以２：１的体积比加入饱和硫酸铵，４。Ｃ５，０００ｒｐｍ离心ｌＯｍｉｎ，弃上清，将沉淀重新悬浮于ＰＢＳ（１３７ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２Ｐ０４ＮａＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ、ｌＯｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＨＰ０４、２ｍｍｏｌ／ＬｐＨ７．４）溶液中，以２：ｌ的体积比再次加入饱和硫酸铵，５，０００ｒｐｍ离心ｌＯｍｉｎ。重复一次。弃上清，将沉淀悬浮于ＰＢＳ溶液中进行透析。透析１２ｈ，每６ｈ更换一次透析液。将透析得到的产物再用ＰｒｏｔｅｉｎＧ纯化试剂盒纯化。§２．３．３．３热启动效果的检测§２．３．３．３．１分子信标指示Ｔａｑ—Ｆｓ常温活性的抑制及加入抗体的最适浓度在ＰＣＲ反应中，为了达到热启动的效果，减少低温下的非特异性的扩增和引物二聚体的产生，我们制备了相应的酶抗体形成抗原抗体复合物，在高温下抗体变性，酶抗原才释放出来发挥活性。但是在反应体系中，如果含过多的蛋白，会导致ＰＣＲ效率严重降低；如果抗体量不足，则无法抑制抗原Ｔａｑ－ＦＳ低温下的活性。所以筛选抗原抗体最适比例很重要。因此，我们结合分子信标检测聚合酶活性的原理，用一条与分子信标的环匹配的引物，与分子信标退火后结合。如果此时体系中的酶存在聚合酶活性，则引物就会得到延伸，分子信标被打开，荧光ＰＣＲ仪就可以检测到分子信标的荧光。我们就可以据此来判断抗体是否和酶形成了抗原抗体的复合物起到了热启动的效果以及选择最适的抗体浓度。２５此反应体系：１０Ｘｂｕｆｆｅｒ２．５止，２ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ：，０．２“ｍｏｌ／Ｌ分子信标，０．４ｐｍｏｌ／Ｌ引物，２００ｐＪｎｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ，０．５ｍｇ／ｍＬＴａｑ—ＦＳ，以不同稀释度的抗体与Ｔａｑ—ＦＳ等体积混合。加入分子信标后立即放置于在Ｍｘ３０００Ｐ上。反应条件：４０℃１２ｍｉｎ，每２ｍｉｎ收集一次荧光信号。９５℃ｌｍｉｎ，然后再４０。Ｃ１２ｍｉｎ，每两分钟收集一次荧光信号。原理如图２—１所示：４５第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用Ｆｉｇｕｒｅ２－１：Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｍｏｌｅｃｕｌａｒｏｆｒｅａｌ－“ｍｅｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｏｆａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｂａｓｅｄｏｎｂｅ．嫩ｏｎ．（ｆｒｏｍＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，３５３：１４１－１４３）§２．３．３．３．２Ｔａｑ＿ＦＳ抗原抗体复合物的制备将最适浓度的抗体与Ｔａｑ—ＦＳ于３７＂Ｃ孵育１ｈ，并５００ｒｐｍ间断性摇动。然后放置在Ｔａｑ℃保存备用。ｓｔｏｒｅｂｕｆｆｅｒ中透析１２ｈ，每６ｈ更换一次透析液。透析产物一２０§２．３．３．３．３热启动灵敏度的检测为了考察热启动酶复合体扩增的灵敏度，将已知浓度的模板进行１０倍梯度稀释，模板的浓度梯度为１０４，１０３，１０２，１０１，１００（ｃｏｐｉｅｓ／ｐＬ），水为空白对照。２５此反应体系：１０×ｂｕｆｆｅｒ２．５止，２ｍｍｏｌ／Ｌ２００ｐＪｎｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ，１％Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ，１ＵＭｇＣｌｚ，０．Ｑｕｎｏｌ／Ｌ引物，Ｔａｑ—ＦＳ和抗体复合物，模板１灿。与不加抗体的Ｔａｑ—ＦＳ及购自大连宝生物工程有限公司的ＴａｑＨＳ进行对照。反应条件：９５℃３ｍｉｎ，９５℃１５ｓ，５５℃２０ｓ，７２℃２０ｓ，５０ｃｙｃｌｅｓ。ＰＣＲ反应后，按０．５。Ｃ／ｓｔｅｐ的升温速率从６５。Ｃ递增至９５℃进行熔解曲线分析。第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用第三节结果§３．１探针检测实时ＰＣＲ体系中的应用结果§３．１．１探针熔解曲线验证Ｔａｑ－ＦＳ５·－－，３’端的外切酶活性降低由于未改造的普通ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有５’＿３’端的外切酶活性，就会因为该外切活性将标记在探针的５’端的荧光基团酶切，使得实时荧光ＰＣＲ仪在循环的开始就检测到荧光信号。而改造后的酶Ｔａｑ—ＦＳ，５’一３’端的核酸外切酶活性降低，对探针的酶切作用减弱，荧光信号较弱。如图３—１所示，在反应的开始，标记在探针５’端的荧光基团被ＴａｑＤＮＡ聚合酶酶切，荧光值迅速升高。而Ｔａｑ—ＦＳ，几乎不对探针进行酶切。与预期的结果一致。ＣｙｃｌｅｓＦｉｇｕｒｅ３－１Ｔｈｅｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｄｅｃｒｅａｓｉｎｇｏｆｔｈｅ５－ｕｕｅｌｅｒａｓｅｏｆＴａｑ－ＦＳ．§３．１．２置换探针验证ＫｌｅｎＴａｑ５·－－，３’端外切酶活性降低ＫｌｅｎＴａｑ是将ＴａｑＤＮＡ聚合酶的Ｎ端２７８个氨基酸去除，彻底消除了５’＿３’核酸外切酶活性。在进行ＰＣＲ扩增时，Ｋ］ｅｎＴａｑ不会对标记在探针５’端的荧光基团进行酶切。如图３—２所示，在反应的开始，标记在探针５’端的荧光基团就被ＴａｑＤＮＡ聚合酶酶切，荧光值迅速升高。形态成一斜线，难以判断其Ｔｍ值。大约４６个循环后达到平台期。ＫｌｅｎＴａｑ不对探针进行酶切。成典型的Ｓ形曲线，大约３０个循环后即达到平台期。结果和预期的一致。４７第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用Ｆｉｇｕｒｅ３－２ＴｈｅｃｏｎｔｒａｓｔｏｆＴａｑａｎｄＫｌｅｎＴａｑｗｉｔｈＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ．§３．１．３Ｔａｑ－Ｎ具有５’＿３’外切酶活性Ｔａｑ—Ｎ含有ＴａｑＤＮＡ聚合酶的Ｎ端，仅表达５’＿３’核酸外切酶活性，会对５·标记荧光的探针进行酶切，使得荧光值在反应的开始就迅速升高。如图３—３所示，在循环的开始就可以看见探针５’端的荧光基团被Ｔａｑ—Ｎ酶切，荧光值迅速升高。结果和预期的一致。ＣｙｃｌｅｓＦｉｇｕｒｅ３－３ＴｈｅｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＴａｑ－ＮｂｙＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＩＬ第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用§３．２在ＰＡＰ技术应用中的结果§３．２．１耐受性考察结果由于Ｋ－ｒａｓ突变型引物末端用ｄｄＮＭＰ封闭，引物３’末端分别为ｄｄＡＭＰ、ｄｄＴＭＰ、ｄｄＣＭＰ和野生型的基因组模板不匹配，所以Ｔａｑ—ＦＳ的焦磷酸水解酶的活性不能发挥，末端封闭的ｄｄＮＭＰ无法脱落，引物得不到延伸，没有产物合成。而用该突变型的引物扩增突变型的质粒模板，由于引物的末端和突变型的模板相匹配，Ｔａｑ－ＦＳ发挥焦磷酸水解酶的活性，使得引物末端的ｄｄＮＭＰ脱落，引物得到延伸，有产物合成。如图３－４所示，用突变型引物扩增５００ｎｇ、５０ｎｇ、５ｎｇ、０．５ｎｇ的野生型基因组模板，没有产物的生成。而用突变型的引物扩增突变型的质粒模板，可以明显的检测到产物荧光值的升起。说明Ｔａｑ－ＦＳ可以用于该体系用于突变的检钡ＩＩ。４９第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用１２－１－Ａ１２－２．Ｃ一●５０唧—，一５∞阳巴三翌三…＿‘—。。一——＿－■州ｃｙｃｌｅＮｕｍｂｅｒＣｙｃｌｅＮｕｍｂｅｒ１２．１．Ｔ１２．２．Ａ—－一５００ｎｇ—．＿５０ｎｇ５ｎｇ８８∞ｓｍｖⅫｎｎＩ罂三ＣｙｃｌｅＮｕｍｂｅｒＣｙｃｌｅＮｕｍｂｅｒ１２．１．Ｃ１２－２．Ｔ一５００ｐｇ巴巴三三－－……”……ＣｙｃｌｅＮｕｍｂｅｒＣｙｃｌｅＮｕｍｂｅｒＦｉｇｕｒｅ３－４Ｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｍｐｌａｔｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｗｉｔｈｍｕｔａｔｅｄｐｒｉｍｅｒ．§３．２．２灵敏度考察结果第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用为了考察Ｔａｑ—ＦＳ用于ＰＡＰ技术检测Ｋ—ｒａｓ基因突变的灵敏度，六条两个位点的突变型引物分别扩增相应的突变型质粒模板，模板连续１０倍梯度稀释，用前面建立的体系进行检测。如图３—５所示，这六条两个位点的突变型引物可以很好的对突变进行检测。所有的反应都可以检测到至少５个拷贝的突变型质粒模板。结果表明，如果模板存在于反应体系中，该体系几乎能够检测到单个的ＤＮＡ突变。１２．１．Ａ１２．２．Ｃ１２．１－Ｔ１２．２．Ａ１２．１．Ｃ１２．２．ＴＦｉｇｕｒｅ３－５Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｍｐｌａｔｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｗｉｔｈｍｕｔａｔｅｄｐｒｉｍｅｒ．５１第二章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用§３．２．３特异性考察结果为了考察上述体系的特异性，设计用Ｋ－ｒａｓ基因突变型引物分别从大量的野生型基因组模板中检测到突变型质粒模板的能力。将上述灵敏度实验中可以检测到的最低浓度即５ｃｏｐｉｅｓ的突变型质粒模板置于４００ｎｇ、２００ｎｇ、ｌＯＯｎｇ、５０ｎｇ、５ｎｇ、０．５ｎｇ以及Ｏｎｇ的野生型基因组ＤＮＡ中。如图３—６所示，突变型的质粒模板在不同量的野生型基因组模板中，都可以被很好的检测。该体系具有很好的特异性。１２．１－Ａ１２—２一Ｃ么１２．１．Ｔ１２－２．Ａ．Ｚ１２．１．Ｃ１２．２．ＴＦｉｇｕｒｅ３－６Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｍｐｌａｔｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｗｉｔｌｌｍｕｔａｔｅｄｐｒｉｍｅｒ．５２第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用§３．３酶抗体的应用实现热启动ＰＣＲ的结果§３．３．１ＥＬＩＳ＾法检测抗体滴度以零点血清作为对照，在第八周测得抗体的滴度为１：２０，０００，０００（图３—７一Ａ），经过两个星期后，滴度没有明显提高（图３－７一Ｂ），说明到了第八周特异性ＩｇＧ产生的量到达平台期，心脏采血获得兔子血清。ＡＢ苷１∞＇∞Ｏ１㈣１０哪！Ｏ哪０１∞Ｏ∞ＯＯ１∞１∞Ｏ１锄１∞∞Ｏ１００“，∞Ｏ珊Ｐ，加Ｆｉｇｕｒｅ３－７Ｃｈａｎｇｅｏｆｔｉｔｒｅ．（Ａ）：ｔｈｅｅｉｇｈｔｈｗｅｅｋ，（Ｂ）：ｔｈｅｔｅｎｔｈｗｅｅｋ．§３．３．２分子信标指示Ｔａｑ－ＦＳ常温活性的抑制及加入抗体的最适浓度用分子信标来检测所要加入的最适抗体的浓度用于和酶形成复合物，如图３－８－Ａ所示，没有加抗体的体系中，在检测的开始Ｔａｑ－ＦＳ就发挥了聚合酶活性，检测到较高的荧光值。图３—８一Ｂ所示，在加了酶抗体的热启动体系中，可以见到未稀释的原倍的抗体可以很好的和酶形成复合物，在低温下抑制酶的活性。在高温变性后酶释放，聚合酶活性得到恢复，荧光值升高。５３第二章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用Ｆｉｇｕｒｅ３·８：ｈｏｔ－ｓｔａｒｔｄｅｎａｔｕｒａｌｉｚａｔｉｏｎａｔｏｆｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｄｅｎａｔｕｒａｌｉｚａｔｉｏｎａｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎｓ．（Ａ）Ｂｅｆｏｒｅｄａｓｈｄｏｔｌｉｎｅｓ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ９５。Ｃ；（Ｂ）Ａｆｔｅｒ９５。Ｃ（ｇｒａｙｗｉｔｈｏｕｔａｎｔｉｂｏｄｙ；ｂｌａｃｋｓｈｏｒｔｄｏｔｌｉｎｅｓ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈａｎｔｉｂｏｄｙｄｉｌｕｔｅｄ４－ｆｏｌｄｓ；ｄａｒｋｇｒａｙｄａｓｈｌｉｎｅｓ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗｉｔｌｌａｎｔｉｂｏｄｙｄｉｌｕｔｅｄ２－ｆｏｌｄｓ；ｂｌａｃｋｓｏｌｉｄｄｉｌｕｔｉｎｇ；ｇｒａｙｓｏｌｉｄｌｉｎｅｓ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗｉｍａｎｔｉｂｏｄｙｗｉｔｈｏｕｔｌｉｎｅｓ：ｂｌａｎｋ．）§３．３．３热启动ＰＣＲ灵敏度的检测将加入抗体的Ｔａｑ－ＦＳ与不加抗体的Ｔａｑ—ＦＳ及购自大连宝生物工程有限公司的ＴａｑＨＳ进行对比。如图３－９－Ａ所示，起始的模板浓度越低，达到仪器检测域值的循环数（Ｃｔ）越高。ＰＣＲ扩增后对产物进行熔解曲线分析，如图３—９一Ｂ所示，目的产物的熔点在８６。Ｃ，产生的两种引物二聚体的熔点在７９。Ｃ和８２℃。可见，不加抗体的Ｔａｑ—ＦＳ只能对１０３ｃｏｐｉｅｓ的模板进行扩增，而ＴａｑＨＳ及使用多抗热启动Ｔａｑ－ＦＳ均能对几乎１个拷贝的ＤＮＡ进行扩增。如图３—１０所示，在热启动ＰＣＲ中，初始ＤＮＡ模板的拷贝数浓度与其ｃｔ值成良好的线性关系。表明热启动ＰＣＲ体系具有对低浓度的模板进行扩增的能力，提高了ＰＣＲ反应的特异性与灵敏度。第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用ＴａｑＦｓ］岳矿Ｊ·１０３圈兰０ｂ种．１。·＿■ｒｂａｎｋ／。≯ｑ·扩‰∥≯。ｊ；。。。。。戡．，邯广旷哥≯．熙矽∑豳疋手．Ｉ１０。亭ＩＴａｑＦＳ＋ａｎｔｉｂｏｄｙ１‘·一，’１：．广－Ｉ．．．∥，·‘，∥，．·彩Ｆｉｇｕｒｅ３－９：Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．（Ａ），Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｗｈｉｃｈｉｓｄｉｌｕｔｅｄ１０一ｆｏｌｄｓＰＣＲｕｓｉｎｇｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｆｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１．Ｏ×ｌＯｏ．１，Ｏｘｗｉｔｈｔｈｅｔｅｍｐｌａｔｅｓｔｈｅｒａｎｇｅ１０４ｃｏｐｉｅｓ／ｍ１．（Ｂ），ＭｅｌｔｉｎｇｃｕｒｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓａｎｄｐｒｉｍｅｒ－ｄｉｍｅｒｓ．“驼∞船如“盐∞１∞Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｆｉｏｎ１∽１０∞０Ｆｉｇｕｒｅ３－１０：ＴｈｅｌｉｎｅａｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｅｏｎｅｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＤＮＡ．ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｃｙｃｌｅｖａｌｕｅｓａｎｄｔｈｅ５５第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用第四节讨论随着核酸内切酶的发现，７０年代初人们就能通过分子克隆的方法从生物材料中得到目的基因，并对之进行扩增。整个的过程需要１－２周的时间才能完成。８０年代中期，建立了聚合酶链反应（ＰＣＲ），整个扩增过程在短短的２－３ｄ、时内就能完成。使得分子克隆技术得到突破性的进展㈨。Ｋｌｅｎｏｗ片段是最早用于ＰＣＲ的ＤＮＡ聚合酶，酶在ＤＮＡ变性的温度下也发生变性，故在每一个循环中，需要重新加入，费时费力，而且随着ＤＮＡ聚合酶的多次加入聚合酶体系粘度越来越大，最后导致扩增反应无法持续。加上该酶的退火温度偏低（３７。Ｃ）容易形成引物与模板的非特异性结合，产生非特异性的扩增。１９８６年Ｈ．ＡＥｒｌｉｃｈ从一种生活在温度高达７５℃的热泉中的细菌Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｏｕｓ中分离出ＴａｑＤＮＡ聚合酶，ＲａｎｄａｌｌＫ．Ｓａｉｋｉ等人成功将其应用与ＰＣＲ，该酶具有良好的热稳定性不需在每轮反应中补加，很好的解决了Ｋｌｅｎｏｗ进行ＰＣＲ反应的不足。对病原微生物进行溯源、个体识别、遗传病筛查以及对器官移植等方面，基因分型具有重要的意义，而利用基于ＰＣＲ反应的探针检测技术进行基因分型得到越来越广泛的应用。但是在探针检测过程中，常在检测的开始就检测到荧光值，看不到典型的Ｓ型曲线的升起，推测是由于ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有５’－÷３’核酸外切酶活性，会将标记于探针５’端的荧光基团酶切，从而影响结果的判读。我们成功的将ＴａｑＤＮＡ聚合酶进行了改造，通过定点突变和缺失突变得到了Ｔａｑ—ＦＳ和ＫｌｅｎＴａｑ，大大降低了ＴａｑＤＮＡ聚合酶５’＿３’核酸外切酶活性。较好的克服了探针被酶切的缺点。并制备了只有ＴａｑＤＮＡ聚合酶Ｎ端３２２个氨基酸的Ｔａｑ—Ｎ，仅保留了酶的５’＿÷３核酸外切酶活性进一步证实了探针５’端的荧光基团被酶５’＿３’核酸外切酶活性酶切的推测。ＰＡＰ技术即焦磷酸水解催化的聚合反应技术，用于稀有突变的检测可以对单个碱基的区别进行区分。在体系中，只有当引物的３’端完全和模板ＤＮＡ序列配对的时候，聚合酶才能发挥其焦磷酸酶的活性，使得引物末端的ｄｄＮＭＰ脱落，引物才可以得到延伸。我们用普通的ＴａｑＤＮＡ聚合酶加入到反应体系中进行检测，几乎检测不到荧光信号，说明ＰＡＰ引物末端的ｄｄＮＭＰ并没有脱落，引物没有得到延伸。ＴａｑＤＮＡ聚合酶属于ＤＮＡ聚合酶Ｉ家族的成员，研究发现在接纳ｄｄＮＴＰ和ｄＮＴＰ上，ＴａｑＤＮＡ聚合酶对ｄｄＮＴＰ存在抵抗口副，同时还存在着第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用对四种ｄｄＮＴＰ抵抗程度的不同口引。所以ＴａｑＤＮＡ聚合酶无法运用于ＰＡＰ技术。而同属于聚合酶Ｉ家族的Ｔ７ＤＮＡ聚合酶则可以很有效的结合ｄｄＮＴＰ。对这两种酶序列进行比对发现表达聚合酶活性的结构域中，活性位点的氨基酸残基在Ｔ７ＤＮＡ聚合酶是第５２６位的氨基酸即酪氨酸，而ＴａｑＤＮＡ聚合酶则是第６６７位点的氨基酸即苯丙氨酸。我们改造得到的Ｔａｑ—ＦＳ就包含了Ｆ６６７Ｙ的突变，所以将其用于ＰＡＰ技术中，成功的对肠癌Ｋ—ｒａｓ基因的第１２位密码子的第一和第二位的核苷酸突变进行检测，从１０６个野生型细胞中检测出１０个突变型细胞的存在。在稀有突变的检测方法中，ＰＡＰ技术与其他单链构象多态性（ＳＳＣＰ）、异源双链技术（ＨＡ）、变性的高效液相色谱法（ＤＨＰＬＣ）、变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）、化学错配裂解法（ＣＭＣ）、质谱法以及ＤＮＡ芯片技术等比较，方便、快速、成本低而且有较高的灵敏度和特异性，在进行疾病的分子诊断中可以避免假阳性结果的产生。所以Ｔａｑ—ＦＳ的改造有着重要的意义。１９９１年Ｄ’Ａｑｕａｉｌａ等口６１正式提出热启动ＰＣＲ概念，即在高温（７０。Ｃ左右）下使酶、模板ＤＮＡ与引物混合，并与传统ＰＣＲ进行对比实验，发现热启动ＲＣＲ可显著增加特异产物的量，减少非特异的产物和背景。其后Ｃｈｏｕ等口７１对这一技术与标准ＰＣＲ进行了严密的实验比较，证实室温下加样所形成的引物错配和引物二聚体是影响ＰＣＲ特异性和敏感性的两个重要原因。这对目的片段的扩增是非常不利的，尤其是对低浓度的模板进行扩增时，往往会因为形成大量的引物二聚体或者是非特异性的扩增而导致得不到目的产物。热启动可避免ＰＣＲ反应中引物与模板的非特异性复性和扩增，这对扩增大片段核酸非常重要。Ｇｕｎｔｈｅｒ等口钔在用ＥＸｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙ扩增系统扩增全长ＨＢＶ基因时，采用热启动方法，大大提高了基因扩增的特异性和灵敏性。目前提高聚合酶反应温度，达到热启动ＰＣＲ的方法有很多。早期通过物理隔绝的方法，步骤烦琐，容易造成污染。而现在使用经过化学修饰起到热启动作用的ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ和ＨｏｔｓｔａｒｔＴａｑ，有较高的特异性但是由于酶活性的恢复需要经过９５℃５—１５ｍｉｎ且反应的ＰＨ≤８．３，长时间的暴露在９５℃下容易造成ＤＮＡ模板的脱嘌呤和断裂，而且这些酶都比较昂贵。我们则利用酶的抗体，在低温下形成抗原抗体复合物使得酶失活，在９５℃ｉｍｉｎ后使得抗体变性，聚合酶释放恢复活性。我们运用了普通的ＰＣＲ体系，加入了酶和抗体的复合物对不同浓度的模板进行５７第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用扩增，和没有加抗体的酶体系进行对照，在模板浓度达到１０２个拷贝时几乎不产生非特异的扩增和引物二聚体。同时灵敏度提高了３个数量级，可以扩增几乎一个拷贝数的ＤＮＡ模板。这种通过形成抗原抗体复合物达到热启动ＰＣＲ目的的方法的建立，具有着重要的意义，是提高ＰＣＲ特异性的重要方法之一。参考文献【１】ｄｅＫｏｋＪＢ，ＷｉｅｇｅｒｉｎｃｋＥＴ，ＧｉｅｓｅｎｄｏｒｆＢＡ．ｅｔａ１．ＲａｐｉｄＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇｏｆＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓＵｓｉｎｇＮｏｖｅｌＭｉｎｏｒＢｉｎｄｉｎｇＤＮＡＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（ＭＧＢＰｒｏｂｅｓ）［Ｊ】．ＨｕｍＭｕｒａｔ，２００２，１９（５）：５５４－５５９．【２】ＬｙｏｎＥ—Ｍｕｔａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｅｘｐｅｒｔ［３】ＭａｒｒａｓＳＡ，ＫｒａｍｅｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎＲｅｖＭｏｌｕｓｉｎｇｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｂｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｐｒｏｂｅｓａｎｄｍｅｌｔｉｎｇｃｕｒｖｅＤｉａｇｎ，２００１，１（１）：９２－１０１Ｓ．ＭｕｌｔｉｐｌｅｘｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＦＲ，Ｔｙａｇｉｓｉｎｇｌｅ—ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｖａｒｉａｔｉｏｎｓｕｓｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎｓ［Ｊ］．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０００，１８（１１）：１１９１－１１９６．［４】ＬｉＱ，ＬｕａｎＧＧｕｏＱｅｔａ１．Ａｎｅｗｃｌａｓｓｏｆｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｎｕｃｌｄｃａｃｉｄｐｒｏｂｅｓｂａｓｅｄｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ】．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２００２，３０（２）：Ｅ５．Ｑ．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｕｓｉｎｇｄｉｓｐｌａｃｉｎｇ【５］ＣｈｅｎｇＡｃｉｄｓＪ，ＺｈａｎｇＹＬｉｐｒｏｂｅｓ［Ｊ】．ＮｕｃｌｅｉｃＲｅｓ，２００４，３２（７）：Ｅ６１．ＣＪ，ＣｏｔｔｏｎＳＡ．ｅｔａ１．ＡＰＣＲ－ＲＦＬＰＴｙｐｉｎｇａ［６】ＧｂａｄｅｇｅｓｉｎＲＡ，ＷａｔｓｏｎＭｏｌｅｃｕｌｅＥｕｒＪＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＡｄｈｅｓｉｏｎＧｅｎｅＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓａｎｄＡｌｌｅｌｅＦｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓｉｎＮｏｒｍａｌＵＫＰｏｐｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ】．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ，２００２，２９（２）：１０９－１１１．Ｒ．ＳｈｏｒｔＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅＰａｒｔｎｅｒｏｆＤＮＡ【７】Ｄ＇ＡｍａｔｏＭ，ＳｏｒｒｅｎｔｉｎｏＤｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇＰｏｗｅｒＳｔｒａｎｄｓＧｒｅａｔｌｙＥｎｈａｎｃｅｔｈｅｏｆＨｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ：ＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎＨＬＡ—ＤＱＢ１Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ［Ｊ】．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９５，２３（１１）：２０７８—２０７９．［８】ＣｏｏｋｓｅｙＲＣ，ＭｏｒｌｏｃｋＡｎａｌｙｓｉｓＩｄｅｎｔｉｆｙＧＰ，ＨｏｌｌｏｗａｙＢＥｅｔａ１．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ－ＭｅｄｉａｔｅｄＨｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘＰｅｒｆｏｒｍｅｄｂｙＵｓｉｎｇＤｅｎａｔｕｒｉｎｇＨｉｇｈ—ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｔｏＳｅｑｕｅｎｃｅＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｉｎＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＴｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＣｏｍｐｌｅｘＯｒｇａｎｉｓｍｓ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００２，４０（５）：１６１０－１６１６．【９］Ｐａｔｉｎｏ－ＧａｒｃｉａＡ，Ｓｏｔｉｌｌｏ－ＰｉｎｅｉｒｏＥ，ＭｏｄｅｓｔｏＣｅｔａ１．ＳｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｔｈｅＨｕｍａｎＴｕｍｏｒ５８第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用ＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ－Ａｌｐｈａ（ＴＮＦ－Ａｌｐｈａ）ＧｅｎｅＰｒｏｍｏｔｅｒＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｂｙＰＣＲ－ＤＧＧＥＡｎａｌｙｓｉｓ【Ｊ】．ＭｕｔａｔＲｅｓ，１９９９，４０６（２－４）：１２１—１２５．【１０】ＧａｎｇｕｌｙＡ，ＰｒｏｃｋｏｐＤＪ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈａｏｆｓｉｎｇｌｅ－ｂａｓｅｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｂｙｒｅａｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｐｒｉｍｅｒｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘｅｓｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｐｒｏｄｕｃｔｓｆｒｏｍｔｈｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ３９３３．３９３９．ｒｅａｃｔｉｏｎ【Ｊ】．Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９０，１８：【１１】ＢｌｏｎｄａｌＴ’ＷａａｇｅＢ１３ｌＳｍａｒａｓｏｎＳＶＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇＥ１５５．ＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｅｔａ１．ＡＮｏｖｅｌＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＢａｓｅｄＭｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙＡｃｉｄｓＲｅｓ，２００３，３ｆｏｒＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ【Ｊ】．Ｎｕｃｌｅｉｃ１（２４）：【１２】“ｕＱ，ＳｏｍｍｅｒＳＳ．Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｌｙｓｉｓ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ（ＰＡＰ）：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏａｌｌｅｌｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ】。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０００，２９（５）：１０７２·１０７６．Ｓｅｔ【１３］ＪｉＭ，ＨｏｕＰ’Ｌｉａ１．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ－ＢａｓｅｄＭｅｔｈｏｄｆｏｒＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇｏｆＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅｏｆｉｄｅＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓＵｓｉｎｇＤｕａｌ－ＣｏｌｏｒＦｌｕｒｅｓｃｅｎｃｅＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＭｕｔａｔＲｅｓ，２００４，５４８（１—２）：９７－１０５．［１４】ＧｌａｖａｃＤ，ＤｅａｎＭ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＳＣＰ）ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ】．ＨｕｍＭｕｔａｔ，１９９３，２：４０４＿４１４．【１５】ＺｈａｎｇＱ，ＭｉｎｏｄａＫ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｃｏｕｎｓｅｌｉｎｇｉｎｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａｕｓｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ】．ＪｉｍＪＯｐｈｔｈａｈｎｏｌ，１９９５，３９（４）：４３２－４３７～【１６］阮庆国，陆春叶．基因突变分析技术综述［Ｊ】．国外医学遗传学分册，１９９８，２１（５）：２２５—２３１．【１７】ＹｅｒｓｈｏｖＧＢａｒｓｋｙＩＬＢｅｌｇｏｖｓｋｉｙＡ，ｅｔａ１．ＤＮＡａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｄｉａｇｎｏｓｓｔｉｃｏｎｏｌｉｇｏｎｕｃｈｏｆｉｄｅｍｉｃｒｏｅｈｉｐｓ阴．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ，１９９６，９３：４９１３－４９１８．［１８】ＬｅｉＰｉｎｇ，Ｙａｎｇ【Ｊ】．ＬｅｔｔｅｒｓＩｎＳｈｕｉ—ｙｕｎ，ＬｉＹｕ—ｅ．Ａｓｉｍｐｌｅｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍｅｔｈｏｄｔｏａｃｈｉｅｖｅｈｏｔ－ｓｔａｒｔｉｎＰＣＲＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００３，１４（５）：４０３．ＰＣＲ［１９】Ｈｅｂｅｒｔ，Ｂ．，Ｂｃｒｇｃｒｏｎ¨ＪＰｏｔｗｏｒｏｗｓｋｉ，Ｅ．Ｆ，Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄｐａｒａｆｆｉｎｗａｘａｓａｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｂｙｕｓｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎｍｉｘｏｖｅｒｌａｙ叨．Ｍ０１．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１９９３，７：２４９－２５２．Ｌａｌｕ，Ｋ．，Ｌｉｎｄｓｔｏｍ，Ｋ．Ａｎａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｈｏｔｏｆｓｔａｒｔ［２０】Ｋａｉｊａｌａｉｎｅｎ，Ｓ．，Ｋａｒｈｕｎｅｎ，Ｐ…ＪＰＣＲｉｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｉｎｓｍａｌｌｖｏｌｕｍｅｓｕｓｉｎｇｂｅａｄｓＷａｘ－ｅｍｂｅｄｄｅｄｒｅａｃｔｉｏｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｄｒｉｅｄｔｒｅｈａｌｏｓｅ［Ｊ】．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９３，２１：２９５９—２９６０。［２１】Ｈｏｒｔｏｎ，ＲＭ．，Ｈｏｐｐｅ，ＢＬ，Ｃｏｎｔｉ—Ｔｒｏｎｃｏｎｉｋ，ＢＭ．ＡｍｐｌｉＧｒｅａｓｅ：’ｈｏｔｓｔａｒｔ’ＰＣＲｕｓｉｎｇ５９第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用ｐｅｔｒｏｌｅｕｍｊｅｌｌｙ【Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９４，１６：４２－４３．【２２】ｍａｌ［Ｉｌａｎｕｊａｍ，Ｒ．，Ｂｕｒｄｉｃｋ，Ｂ．Ａ．，Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．Ｄ．ａｎｄＳｅｖｉｇｎｙ，Ｐ．Ｍｅｔｈｏｄａｎｄｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｗａｘ—ｅｍｂｅｄｄｅｄ，ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐａｔｅｎｔ１９９７，５，５９９，６６０．ｆｏｒａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｒｅａｇｅｎｔｓ［Ｐ］．ＵＳ［２３】Ｍｏｒｅｔｔｉ，Ｔ．，Ｋｏｏｎｓ，Ｂ．ａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ７１６．７２２．ｕｓｉｎｇＢｕｄｏｗｌｅ，Ｂ。ＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔＤＮＡｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｙｉｅｌｄａｎｄＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ【Ｊ】．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９８，２５：【２４】Ｋａｂｏｅｖ，Ｏ．Ｋ．，Ｌｕｃｈｋｉｎａ，Ｌ．Ａ．，Ｔｒｅｔｉａｋｏｖ，Ａ．Ｎ．ａｎｄＢａｈｒｍａｎｄ，Ａ．Ｒ．ＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓｗｉｔｈｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｈｏｔｓｔａｒｔｕｓｉｎｇｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎｓ（ｈａｉｒｐｉｎ—ｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）［Ｊ】．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２０００，２８：９４—１０２．【２５】Ｋａｉｎｚ，Ｐ．，Ｓｃｈｍｉｅｄｌｅｃｈｎｅｒ，Ａ．ａｎｄＳｔｒａｃｋ，Ｈ．Ｂ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｅｎｈａｎｃｅｄｏｆｄｏｕｂｌｅ·ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡｈｏｂｓｔａｒｔＰＣＲ：ａｄｄｉｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｓａｄａｐｔｅｄｔｏｔｈｅａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０００，２８：２７８—２８２．【２６］Ｄａｎｇ，Ｃ．ａｎｄＪａｙａｓｅｎａ，Ｓ．Ｄ．ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｌｏｗｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒｔａｒｇｅｔｓｂｙｏｆＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｆａｃｉｌｉｔａｔｅ９９６，２６４：２６８．２７８ＰＣＲ【Ｊ】．Ｍ０１．Ｂｉ０１．，１［２７】ＭｉｌｋｏＢ．Ｋｅｒｍｅｋｃｈｉｅｖ，ＡｎａｔｏｌｙＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｐｒｏｖｉｄｅａＴｚｅｋｏｖａｎｄＷａｙｎｅＭ．Ｂａｒｎｅｓ．Ｃｏｌｄ．ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｕｔａｎｔｓｏｆＰＣＲ［Ｊ】．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２００３，３１ｈｏｔｓｔａｒｔｆｏｒ（２１）：６１３９．６１４７．【２８】Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｔ，Ｎｙｂｅｒｇ，Ｂ．ＲａｔｅｏｆｄｅｐｕｒｉｎａｔｉｏｎｏｆｎａｔｉｖｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｆＪ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７２，１１：３６１１－３６１８．［２９】Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｔ．Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ３６２：７０９．７ｌ５．ａｎｄｄｅｃａｙｏｆｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＤＮＡ【Ｊ】．Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，［３０］Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｒｏｍ１ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｏｆｕｐｔｏ３５ｋｂＤＮＡｗｉｔｈｈｉｇｈｆｉｄｅｌｉｔｙａｎｄｈｉｇｈｙｉｅｌｄｔｅｍｐｌａｔｅｓ【Ｊ］．Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９４，９１：２２１６—２２２０．ａｍ＃ｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｌｏｎｇｔａｒｇｅｔｓ［３１］．Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．，Ｆｏｃｌｄｅｒ，Ｃ．，Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．ａｎｄＨｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．ＥｆｆｅｃｔｉｖｅｆｒｏｍｃｌｏｎｅｄｉｎｓｅｒｔｓａｎｄｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ［Ｊ】＿Ｐｒｏｃ．ＮａｉｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９４，９１：５６９５－５６９９．［３２］Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．Ｔｉｐｓａｎｄ１９：３４２．ｔｒｉｃｋｓｆｏｒｌｏｎｇａｎｄａｃｃｕｒａｔｅＰＣＲ阴．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ，１９９４，［３３】Ｂａｎｄｕｒａ，Ａ．ＳｏｃｉａｌＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＴｈｏｕｇｈｔａｎｄＡｃｔｉｏｎ：ＡＳｏｃｉａｌＣｏｇｎｉｔｉｖｅＴｈｅｏｒｙ【Ｍ】．第三章改造后ＴａｑＤＮＡ聚合酶的应用ＥｎｇｌｅｗｏｏｄＣｌｉｆｆｓ，ＮＪ：ＰｒｅｎｔｉｃｅＨａｌｌ，１９８６．【３４】Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ａｎｄｃｏｌｉＤＮＡＣ．Ｃ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ．ＡｓｉｎｇｌｅｒｅｓｉｄｕｅｉｎＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓｏｆｔｈｅＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩｆａｍｉｌｙｉｓｃｒｉｔｉｃａｌｆｏｒｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇｂｅｔｗｅｅｎｄｅｏｘｙ－ａｎｄｄｉｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｐｒｏｅ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，１９９５，９２：６３３９－６３４３【３５】ＹｉｎｇＬｉ，Ｖｅｓｓｅｌｉｎｍｉｔａｘｏｖ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄｄｅｓｉｇｎｏｆＴａｑＤＮＡｏｆｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ谢ｔｌｌｉｍｐｒｏｖｅｄｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ９４９１．９４９６．ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ［Ｊ】．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，１９９９，９６：［３６］Ｄ’ＡｑｕｌａＲＴ，ＢｅｃｈｔｅｌＬＪ，ＶｉｄｅｌｅｒＪＡ，ｅｔａ１．ＭａｘｉｍｉｚｉｎｇｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｔｙｏｆＰＣＲｂｙｐｒｅ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｈｅａｔｉｎｇ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９１，１９（１３）：３７４９［３７】ＱｕｉｎＣｈｏｕ，ＭａｒｉｏｎＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎＲｕｓｓｅｌｌ，ＤａｖｉｄＥ．Ｂｉｒｃｈ，ＪｏｎａｔｈａｎＲａｙｍｏｎｄ，ａｎｄＷｉｌｌＢｌｏｃｈｏｆｐｒｅ－ＰＣＲｍｉｓ··ｐｒｉｍｉｎｇａｎｄｐｒｉｍｅｒｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｉｍｐｒｏｖｅｓｌｏｗ·－ｃｏｐｙ－ｎｕｍｂｅｒＲｅｓ．１９９２，２０：１７１７－１７２３ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ】．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ［３８］ＧｔｉｎｔｈｅｒＳ，ＬｉＢＣ，ＭｉｓｋａＳ，ＫｒｔｉｇｅｒＤＨ，ＭｅｉｓｅｌＨ，ＷｉｌｌＨ．ＡｎｏｖｅｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｗｈｏｌｅｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅｓｐｅｒｍｉｔｓｒａｐｉｄｆｕｎｃｆｉｏｎＭａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｒｅｖｅａｌｓｄｅｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｓｉｎｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄｐａｔｉｅｎｔｓ．［Ｊ】．Ｖｉｒ０１．１９９５，６９（９）：５４３７—４４．６１总结心；日总结我们从ＴａｑＤＮＡ聚合酶的表达载体出发，通过定点突变和缺失突变的方法在基因水平对其进行了定向改造。降低了酶５’－÷３’核酸外切酶活性以及对ｄｄＮＴＰ的抵抗。我们使用了扩增环状质粒全长的方法进行定点突变，只需要一次ＰＣＲ反应，一次ＤｐｎＩ酶解，一次转化就可以完成突变的过程，方法快速、简便。在蛋白纯化过程中，由于ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有良好的耐热性，所以可以通过破碎菌体、高温变性就可以得到分离纯化，满足一般ＰＣＲ反应的要求。为了得到更高纯度的酶蛋白，我们运用了亲和层析的纯化方法，和商品酶进行对照，具有良好的纯化效果。随着ＰＣＲ技术的不断发展，基于ＰＣＲ的各种基因分型技术往往需要应用到探针。荧光双链置换探针具有很好的识别但碱基突变的能力，具有很高的特异性和灵敏度。但是在ＰＣＲ循环初始，就会检测到荧光信号的增强，看不见典型Ｓ型信号升起，影响结果判读。改造后的ＴａｑＤＮＡ聚合酶ＫｌｅｎＴａｑ消除了５’．÷３’核酸外切酶活性，几乎不对探针进行酶切，在ＰＣＲ反应中可以看见典型Ｓ型信号升起，很好的克服了荧光双链置换探针被酶切的问题。ＰＡＰ技术是目前对稀有突变检测最有效的技术之一，普通的７ａｑＤＮＡ聚合酶，由于对ｄｄＮＴＰ具有抵抗，所以不适用于ＰＡＰ技术。而所制备的Ｔａｑ－－ＦＳ由于降低了对ｄｄＮＴＰ的抵抗可以很好的应用于ＰＡＰ技术进行稀有突变的检测，所建立的检测体系具有很好的耐受性，在大量野生型基因组模板存在的体系中，仍不会产生非特异性的扩增。可以检测到至少５个拷贝的ＤＮＡ模板，灵敏度高。且方法方便、快速。因此Ｔａｑ－ＦＳ聚合酶的改造具有重要的意义。普通的ＴａｑＤＮＡ聚合酶在常温下仍具有活性，对ＰＣＲ反应不利。容易产生非特异性的扩增。我们通过制备酶抗体，形成抗原抗体复合物，对常温下酶的聚合活性进行抑制，达到热启动的目的。可以使得一般的ＰＣＲ体系对模板检测的能力从１０３提高到ｌＯｏ，几乎可以对１个ＤＮＡ分子进行扩增。大大的提高了ＰＣＲ反应的特异性和灵敏度。致谢致谢首先，向我的导师李庆阁教授表达最真挚的感谢！本论文无论从选题设计还是实验论证方面，均得到了的悉心指导。三年中，渊博的学识和忘我的工作精神让我留下了深刻的印象，激励我不断前进。感谢本实验室杨薇老师在学习上给予的关心和帮助。特别感谢本实验室的许木于和郭奇伟同学在实验上的倾力相助。感谢顾莹莹、黄秋英、温慧欣、郑琳琳、胡思玉、谢晓婷、阮力、许晔、廖逸群、张恒、张佳峰、柯荣秦等同学在工作和生活上的关心和帮助。林晴厦门大学映雪１２１室２００７．８６３Taq DNA聚合酶的改造及应用

作者：

学位授予单位：

林晴厦门大学

1. 肖朝文 Taq DNA聚合酶制备技术的优化[学位论文]2005

2. 何钢.王义强.李樊.刘贤桂.HE Gang.WANG Yi-qiang.LI Fan.LIU Xian-gui 大肠杆菌表达重组Taq DNA聚合酶的分离和纯化[期刊论文]-中南林学院学报2006,26(5)

3. 汪靖超.李荣贵 重组Taq DNA聚合酶在大肠杆菌中的表达与纯化[期刊论文]-青岛大学学报(工程技术版)2004,19(1)

4. 孙章辉 重组大肠杆菌DNA聚合酶的提取及纯化研究[学位论文]2006

5. 朱含开.赵庆顺.尹大强.ZHU Han-kai.ZHAO Qing-shun.YIN Da-qiang DNA聚合酶对PCR方法检测基因点突变的干扰分析[期刊论文]-环境化学2008,27(1)

6. 王天云.秦川.杨瑞.杨献军 基因重组Taq DNA聚合酶的制备[期刊论文]-新乡医学院学报2007,24(6)

7. 刘莉.陈集双.LIU Li.CHEN Ji-Shuang 利用Taq DNA聚合酶直接从双链RNA模板中扩增靶序列[期刊论文]-微生物学通报2007,34(1)

8. 孙亮先.骆红梅.董海涛.李德葆 以冻融法快速纯化高活力基因工程Taq DNA聚合酶[期刊论文]-江西农业大学学报2001,23(4)

9. 肖朝文.杜娟.李晚忱 Taq DNA聚合酶制备技术的优化[期刊论文]-四川农业大学学报2004,22(4)10. 刘鼎一 Taq DNA聚合酶的定点诱变及保真度研究[学位论文]2008

引用本文格式：林晴 Taq DNA聚合酶的改造及应用[学位论文]硕士 2007