酵母菌的分离纯化
实验目的
1. 了解培养基的配置与灭菌技术； 2. 无菌操作技术；
3. 工业微生物的分离与纯化技术； 4. 工业微生物的检测及保藏。
基本原理
1、 培养基是人工配置的用于培养、分离、鉴定和保存各种微生物的营养基质。也适合微生物在生命活动中积累各种代谢产物。由于微生物种类不同，营养类型各异以及实验目的不同，因此培养基的种类也很多。不同微生物对营养的要求不同，在配置时根据微生物对PH的要求选择合适的PH。由于本次实验主要是分离纯化酵母菌，所以配置的培养基是适合酵母菌生长麦芽汁平板培养基，同时添加抗生素抑制霉菌及其它菌的生长。
2、 接种和培养过程中必须保证不被其它微生物所污染，关键在于严格进行正确的无菌操作，但是绝对无菌是不可能的，只能人工创造相对无菌的环境。所以本次实验无菌操作是在超净工作台的酒精灯火焰旁进行。
3、 把特定微生物从混杂的微生物群体中分离出来而获得某一种或某一株微生物的过程叫微生物的分离与纯化。首先根据其生长特性设计只利于此菌生长的条件，再根据各种稀释法使他们在固体培养基上单独长成菌落。分离纯化的方法通常有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法和平板划线。此次实验采用梯度稀释涂布平板法。
4、 微生物检测项目最常用的是细胞数的检测，方法比较多，主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法（CFU）、光电比浊计数法等。本次实验设计酵母菌的数量检测，选用显微镜直接计数法和平板菌落计数法。
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实验器材
仪器设备
恒温水浴锅、电热干燥箱、蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、水浴锅、电炉、铜锅、酒精灯、接种环、电子天平、研钵、光学显微镜、血细胞计数器 玻璃器皿
烧杯、锥形瓶、大小试管、培养皿、漏斗、三角涂棒、吸管、试管架、玻璃涂棒、盖玻片
试剂与材料
苹果、大麦芽、琼脂、蒸馏水、碘液、抗生素、染色液 其它
纱布、滤纸
实验内容及操作步骤
(一)、样品的选择
酵母菌一般在果园的土壤中或者水果的表面含量较多，因此选择苹果为样品。 （二）、样品的处理
制备苹果悬液
1. 首先将1g苹果在研钵中磨细，放入装有10ml生理盐水和玻璃珠的100ml三角瓶中去。 2. 激烈震荡约10min,使菌体分散并悬浮与液体中。
3. 用无菌吸管吸取1ml苹果悬液注入盛有9ml生理盐水的试管中，吸取三次并混匀。 4. 再去一只无菌吸取管，从此试管中吸取1ml，注入另一盛有9ml生理盐水的试管中，取
三次并混匀。
5. 同法类推制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的各种稀释度的苹果悬液。
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（三）、培养基的制备与灭菌
1、培养基的选择：选择麦芽汁为培养基培养酵母菌 2、麦芽汁琼脂培养基的制备
取新鲜麦芽汁200mL在65℃水浴中糖化3—4小时，糖化程度可用碘滴定之。加水 约400mL，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。将糖化液用4—6层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用鸡蛋白澄清，方法是将一个鸡蛋白加水约20mL，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。 将滤液稀释到5—6波美度，pH约6.4，加入2%琼脂即成。121℃灭菌30min。培养皿采用干热灭菌（蒸汽灭菌锅）
生理盐水
称取氯化钠0.43g，加入50ml水，装入100ml小锥形瓶中，灭菌备用。 3、 分装
已过滤灭菌的培养基应进行分装。因要制作平板和斜面培养基，所以需将培养基分装于培养皿和试管中。 分装时，一手捏松弹簧夹，使培养基流出，另一只手握住几支试管或培养皿，依次接取培养基。分装时，注意不要使培养基粘附管口或培养皿口，以免浸湿棉塞引起杂菌污染。 装入试管的培养基量，视试管和培养皿的大小及需要而定。一般制作斜面培养基时，每只15×150毫米的试管，约装3～4毫升（1/4～1/3试管高度），如制作深层培养基，每只20×220毫米的试管约装12～15毫升。 4、加棉塞
分装完毕后，需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是过滤空气，避免污染。棉塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作，不要用脱脂棉，以免因脱脂棉吸水使棉塞无法使用。制作棉塞时，要根据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度，揪取手掌心大小一块，铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中，用右手食指插入棉花中部，同时左手食指与姆指稍稍紧握，就会形成
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1个长棒形的棉塞。棉塞作成后，应迅速塞入管口或瓶口中，棉塞应紧贴内壁不留缝隙，以防空气中微生物沿皱折侵入。棉塞不要过紧过松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。棉塞的2/3应在管内或瓶内，上端露出少许棉花便于拔取。塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札，准备灭菌。 5、制作斜面培养基和平板培养基
培养基灭菌后，制作斜面培养基和平板培养基，须趁培养基未凝固时进行。 (1)制作斜面培养基。在实验台上放1支长0.5～1米左右的木条，厚度为1厘米左右。将试管头部枕在木条上，使管内培养基自然倾斜，凝固后即成斜面培养基。
(2)制作平板培养基。将刚刚灭过菌的盛有培养基的锥形瓶和培养皿放在实验台上，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，左手拔下棉塞，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧，左手打开培养皿盖，右手迅速将培养基倒入培养皿中，每皿约倒入10毫升，以铺满皿底为度。铺放培养基后放置15分钟左右，待培养基凝固后，再5个培养皿一叠，倒置过来，平放在恒温箱里，24小时后检查，如培养基末长杂菌，即可用来培养微生物。 （四） 、样品的分离纯化
1、 倒制平板
将麦芽汁琼脂培养基加热熔化，冷却至55-600C。 加入抗生素1ml并混匀。
在超净工作台的酒精灯火焰旁倒制平板。 2、 涂布平板
将上述培养基的5个培养基的四个平板分别标上10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五种稀释度。
取5只无菌吸管，分别从四种苹果悬液的稀释液中各取0.1ml。
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对号放于已标记好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻涂布均匀。 重复以上4步骤。
3、倒置培养
将培养基平板倒置，与30-320C温箱中培养2天。 4、观察挑菌
观察培养后长出的酵母菌的单个菌落，分别挑取并接种于斜面培养基上，再培养。待菌苔长好后，检查是否有杂菌，若有则需再一次进行分离纯化，直到获得纯菌株培养物。 5、最大然数法计数
原每毫升样品中酵母数量=稀释倍数*最大然数 （五）、酵母菌的制片、染色及形态观察以及计数
酵母菌的个体形态一般可采用水浸片进行活体观察。 1、 观察菌落和菌苔并记录菌落形态特征 制作酵母菌水浸片显微标本片
1、 在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水，用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，
置 载玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1厘米的薄层，为避免因菌数过多聚成集团，不利观察个体形态，可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层，若材料为液体培养物或固体培养物中洗下制备的菌液，则直接涂布于载玻片上即可。 2、 酵母菌美蓝水浸片的制作：染色--------加盖玻片--------观察鉴别 3、 酵母菌碘液水浸片的制作：制片---------染色
4、 酵母菌子囊孢子染色标本片的制作：菌种活化----------产孢培养--------制片-------染
色-------脱色----------复染---------镜检。
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计数、采用显微镜直接计数。
将酵母菌悬浮液放在血细胞计数器的载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下直接进行计数。
注:第一大组第三小组 杨鑫090603021 涂强090603037 钟俊090603031
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