响应面分析法用于微生物培养基浓度的优化

第３２卷第１期　２００２年３月　工业微生物　Ｖ０Ｉ　３２　Ｎｏ１　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍａｒ　２００２　响应面分析法用于微生物培养基浓度的优化　胡永红，沈树宝，欧阳平凯　（南京化工大学，制药与生命科学学院，南京２１０００９）　摘要　首次将响应面分析击（ＲＳＭ）用于延胡索酸酶产生茵产氨短杆菌ＭＡ　２和黄色短杆菌　ＭＡ　３培养基成份的优选，井且取得了良好的结果　经优化后产氨短杆菌ＭＡ　２酶活迭２７　８８×　１Ｏ　＊＊ｍｏｌ／ｇ・ｈ．黄色短杆菌ＭＡ　３酶活达３２　２６×１０　．ｕｍｏｌ／ｇ・ｈ．较Ｉａｔ内外文献报道的其它产氨短杆　菌、黄色短杆菌单住茵悼延胡索酸酶活力有显著提高。　关键词：响应面分析法；培养基；优化　国内外对产酶条件中培养基各组分浓度优化的　报道往往是采用单因素多水平的优化．未考虑碳源、　氮源、无机离子等多个因素之间的协同作用。本研　究将响应面分析法（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｍｅｔｈｏｄ．　ＲＳＭ）用于微生物培养基浓度的优化，并以产氨短　左右．灭菌后备用。　１．２．１．２黄色短杆菌ＭＡ－３发酵培养基成份（％）　丙二酸２．２．Ｋ　ＰＯ４　０　２，ＭｇＳＯ４’７Ｈ２Ｏ　Ｏ．０５，　玉米浆３．２，用３０％ＮａＯＨ调节ｐＨ至７．５左右。灭　菌后备用。　１．３培养条件　杆菌ＭＡ一２和黄色短杆菌ＭＡ．３两株产延胡索酸酶　（ｆｕｍａｒａｓｅ）的培养体系为例，对培养基的主要成份　产氨短杆菌ＭＡ．２培养温度为３２～３４℃．培养　时间为２４ｈ，摇床转速１８０ｒ／ｍｉｎ。黄色短杆菌ＭＡ．３　浓度进行了优化。实验结果表明：产氨短杆菌ＭＡ．　２、黄色短杆菌ＭＡ．３的酶活力较采用响应面分析法　优化前提高１０％．其中，产氪短杆菌ＭＡ．２酶活力　达２７　８８ｘ１０Ｊ，ｕｍｏｌ／ｇ　ｈ．黄色短杆菌ＭＡ．３酶活达　３２　２６ｘ１０　ｖｍｏｔ／ｇ．ｈ，较国内外文献报道的其它产　氨短杆菌和黄色短杆菌单位菌体延胡索酸酶活力有　显著提高。　培养温度为３０～３２＊（３。培养时间为３６ｈ，摇床转速　１８０ｒ／ｒａｉｎ。　１．４分析方法　游离细胞延胡索酸酶活力的测定方法详见文献　『ｌ～３］　１材料和方法　１．１菌株　产氨短杆菌ＭＡ．２（Ｂ．ａｚｎｍｏｎｉａｇｅｎｅ．￣ＭＡ－２），　２结果与讨论　２．１响应面分析法在优选培养基适宜浓度中的应　用　黄色短杆菌ＭＡ．３（Ｂ．　ｎ　“ｍ　ＭＡ　３）均为本课题组　筛选获得。　１．２培养基组成　碳源、氮源和金属离子对微生物培养有显著影　响。在产延胡索酸酶菌株产氪短杆菌ＭＡ．２培养体　系中柠檬酸氢二铵、玉米浆、ＭｇＳＯ４　７　Ｏ对菌体　培养及延胡索酸酶活力影响较大，而在黄色短杆菌　１．２．１斜面培养基　上述两菌株皆于普通肉汤培养基中培养．其成　份为：蛋白胨１％，牛肉膏０　５％，氯化钠Ｏ　５％。　１．２．１．１产氨短杼菌ＭＡ－２发酵培养基成份（％）　柠檬酸氢二铵３　２，ＫＨ２Ｐｑ　Ｏ　２．ＭｇＳＯ４－７Ｈ２Ｏ　０．０５，玉米浆３．５％，用３０％Ｎａ０Ｈ调节　Ｈ至７　５　第一作者ｆ｝；ｉ舟：胡隶红（１９６８～）．女．博士．副教授　ＭＡ．３培养体系中雨二酸、玉米浆、ＭｇＳ０４－７Ｈ２０对　菌体培养及延胡索酸酶话力影响显著…。从试验　结果及应用的角度考虑，必须选择既有利于提高两　菌培养，又有利于提高产延胡索酸酶的培养基浓度，　因此，本研究采用响应面分析法（ＲＳＭ）　分别来　维普资讯 http://www.cqvip.com

第Ｌ期　Ｉ业微生物　第３２卷　优选产氪短杆菌：ｖＬａ．一２和黄色短杆菌ＭＡ　３培养所　水平设置如表１。　需成份的适宜浓度范围，试验的培养基浓度与编码　表１试验的培养基浓度与共编码水平　在考虑三种因素对产氪短杆菌ＭＡ一２和黄色短　杆菌ＭＡ一３产延胡索酸酶影响时，采用了Ｂｏｘ—Ｗｉｌ—　ｓｏｎ的中心组合设计，用表１设置的三因素五水平　方式分别进行１６组试验，结果见表２、３，选用响应　Ｅ眦＾．３　０＋　１Ｙｌ＋Ｃ２Ｙ２＋Ｃ３２　３＋　ｌ２　１　２＋　．．Ｃ１３Ｙ１　３＋Ｃ２３Ｙ２　３＋　１１Ｙ】２十Ｃ２２　２２十Ｃ３３　３２（２）　上两式中：ＥＭ　２和Ｅ，ｕａ　３分别为单位重量产氪　短杆菌ＭＡ一２和黄色短杆菌ＭＡ－３的延胡索酸酶活　面分析法（ＲＳＭ）中适合的方程式分别为：　ＥＭ　２＝ｂ０十ｂｌ　１＋６２　２十ｂ３．ｘ＂３＋ｂｌ２Ｘｌ　０７＂２＋　力；３２１，（　１）分别为柠檬酸氢二铵和丙二酸的浓度；　上２，（Ｙ２）为玉米浆浓度；　３，（　３）为ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０浓　度，ｂ０，ｂ１…及ｆ０，ｃ１…为各项系数。　６１３　１　３＋ｂａ３　２上３＋ｂｌＩ　１　＋６２２上２　＋ｂ３３上３　（１）　表２产氧短杆菌ＭＡ－２的实验设计和结果　一ｌ０　维普资讯 http://www.cqvip.com

第１期　胡永红，等：响应面分析法用于微生物培养基浓度的优化　表４上述实验得到的系数　变量常数　ｘＩ　２　Ｘ】　第３２卷　实验结果用多重回归技术进行分析，并借助　ＳＴＡＴＩＳＴ１ＣＡ　５　０软件计算出上述方程各项系数，　系数　ｌ５３２０．７　８３５２２６　６　７５９６　２　变量常数　系数　ｌｇ２３６　９　１６２００６３　结果见表４，回归方程的相关系数Ｒ２达到０　９５以　上，这说明该方程适用于产氨短杆菌ＭＡ一２、黄色短　杆菌ＭＡ　３产酶高低的理论预测。为了进一步探讨　回归方程预报的实验结果与实际结果相符合程度，　将实验值与模型计算值相比，由表２、３可见，模型预　报的结果与实际实验结果相当一致，相对误差在±　５　Ｏ％以内。　ｙ；　７５８１　５　１　２　ｘｌ　Ｘ２Ｘ】　ｘ　ｘ＾　‘　５１５２２　５　３１７．５　１５２５３　—２９８７　６　一１　０４Ｅ＋０７　一ＹＪ　ｙＪｙ３　２０７５３　８　１８６　２　４４７５４　８　ＹＪ　ｙ：　一２６８１　４　一１　７６Ｅ＋０７　根据ＲＳＭ法分析数据可以绘出响应面及其等　高线图，以确认碳源、氮源及硫酸镁三因素，分别对　产氨短杆菌ＭＡ一２和黄色短杆菌ＭＡ一３细胞中延胡　索酸酶活力的影响，图ｌ绘出了碳源、氮源与酶活力　的三维响应面图；　１３８０　７　３０３９５　７　０　９６４　ｙ】　‰　Ｒａ　一１６１９　２　一３２７７１　８　０　９５５　一Ｒ１　产氨短杆菌ＭＡ一２　黄色短杆菌ＭＡ一３　图１　产氨短杆茴ＭＡ一２和黄色短杆菌ＭＡ一３酶活与碳源氮源响应面分析图　．－．．．．．．．．．　２．２培养基组成最佳浓度的获取　为了更进一步确证培养基成份的虽佳点，对已　回归的非线性模型方程求一阶偏导，并令其等于零，　可以得到曲面的最大点，求导方程整理得：　对于产氨短杆菌ＭＡ一２有：　１５３２０．７０＋５１５２２　４５ｚａ＋３１７　５１ｚ３—２×２９８７　６ｘ１　ｕ　８３５２２６　６＋５１５２２　４５ｘｌ＋１５２５３　０１ｘ３—２×１０４２７０００ｘ１　２７－８７×１０　＃ｍｏｌ／ｇ‘ｈ。　船勰　黜　３ｉ｝７　对于黄色短杆菌ＭＡ一３同样可求得培养基最佳　浓度为丙二酸２　２２％，ＭｇＳＯｄ・７Ｈ２Ｏ　０．０５％，玉米　浆３　ｌ８％。此时，理论上单位黄色短杆菌ＭＡ一３菌　体延胡索酸酶活力达３２　２８×１００　１１１。１／ｇ・ｈ。　２．３方程的验证　Ｏ　以该法选出的虽适宜培养基浓度进行发酵试　７５９６　２４＋３Ｕ．５１ｘ１　１５２５３、０ｌｘ２—２×１３８０．７ｈ］　０　验，单位菌体产氨短杆菌ＭＡ－２的延胡索酸酶活力　求解上述三元一次方程。得出对于产氨短杆菌　ＭＡ一２的最佳条件为：　ｚ】＝３　１９　ｚ２＝０　０５　］＝３　５１　Ｅ＝２７．８７×１０　达２７．８８×１０　９ｍｏｌ／ｇ・ｈ，实验值与模型计算值相差　０．０３６％．同样黄色短杆菌ＭＡ　３单位菌体延胡索酸　酶活力达３２．２６×１０　￣ｍｏｌ／ｇ・ｈ，实验值与模型计算　．即培养基虽佳浓度为：柠檬酸氢二铵３．１９％，　ＭｇＳＯ４。７Ｈ２Ｏ　０．０５％，玉米浆３．５１％　此时，理论　值相差Ｏ．０６％，证明了用ＲＳＭ法来寻求两菌虽佳　培养基浓度是可行的。并表明其结果比优化前提高　了１Ｏ％，比国内外报道的其它菌株有一定提高。　上单位产氨短杆菌ＭＡ一２菌体延胡索酸酶活力达　维普资讯 http://www.cqvip.com

第ｌ期　工业微生物　报，１９８９．２０：５４～５８　第３２卷　３　结　论　王曹．虞炳军．张福明等；生杆转化法生产Ｌ一苹果醇的研　首次将响应面分析法（ＲＳＭ）用于产氨短杆菌　究：食品与发酵工业，１９９６，１：１８～２２　胡永红，手性苹果醇台戚新技术酗研究；博士学位｛亡文．南京：　南京化工大学，１９９９，８　Ｈａｌｔｒｉｃｈ　Ｄ．Ｐｒｅｉｓｓ　Ｍ．Ｓｔｅｉｎｅｒ　Ｗ　ｏｐｒｉｍｉｍｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｕ］ｔｕ￣ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｘｙｌａｎａｓｅ　ｐｒｏｄ￣ｌｉｏｎ　ｂｙ　ａ　ｗｉｌｄ￣ｔｒａｉｒ，ＤＩ　Ｂｃｈｌｚ＜）Ｄｈｙ［ｉａｍ　ａ　ｍ…Ｅｎｚ！￣ｅ　Ｍｉｅｒｏｂ　Ｔｅｃｈｎｏ１．１９９３．１５：８５４～８５８　ＭＡ　２、黄色短杆菌ＭＡ一３两株延胡索酸酶产生菌培　养基适宜浓度的优选，并且取得了良好的结果。较　国内外报道的多种产氪短杆菌和黄色短杆菌细胞中　单位菌体延胡索酸酶活力有一定的提高，且本法有　望用于其它微生物过程的培养基条件优选。　参考文献　魏文玲．郯忠辉，　志戚等克鲁维酵母Ｙ一８５台成菊粉酶最　适条件的研究．微生物学撒，１９９８．３８（３】：２０８～２１２　ｂ￣ｄｄｏｘ　１　Ｓ，Ｒｉｃｈｅｒｔ　Ｓ　Ｈ．ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｉｈｂｅｒｄｌｉｅ　ａｃｉｄ　ｕｓ／ｒｉｇ　ａ　ｄａｉｒｙ　Ｒ　Ｊ　Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｙ　Ｐａｌｅｒ．Ｊ　Ｓ　Ｒｏｋｅ￣，ｅｃ　ａＩ　Ｌ－Ｍａ］ｉｃ　ａｃｉｄ　ｉ＇ｏｒｍａｒｉｏｎ　ｂｙ　ｂＩｌｌ　ｄ　Ｓａｃｃｈａｒｃｍｙｃ￣ｃ￣ｖｉｓｉａｅ　ａｍｐｌｉｉｆｅｄ　ｆｏｒ　ｆｍｎａｒａｓｅ；　ｅ　ａｓ　ｔｈｅ　ｈａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ　Ｊ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９７７，　４３：１９７～２０４　Ｃｈｅｎ　Ｋ　Ｃ．Ｌ　Ｔ　Ｃ．Ｈｏｕｎｇ　Ｊ　Ｙ　Ｓｅａｒｃｈ　ｍｅｔｈｅｄ　盯ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｍｅｄｉｎａ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄ￣ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉａｅｔａｓｅ　ｂｙ　ｌｄｕｙｖｅｍｍｙｃ￣ｓ　ｆｒａｇｔｌｉｓ　Ｅｎ一　Ｍｉ　ｂ　［＇￣ｈｎｏ１．１９９２，１４（８ｊ：６５９～６６４　ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂＴｅｃｈｎｏ１．１９９１．１３：９９１—９９６　［２］　两卫国。吴梧桐　延胡索酸酶产生翦的筛选中国药科大学学　３　４　５　６　７　８　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｓｐｏｎｅｓ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ＨＵ　Ｙｏｎｇ—ｈｏｎｇ，ＯＵ—ＹＡＮＧ　Ｐｉｎｇ－ｋａｉ，ＳＨＥＮ　Ｓｈｕ—ｂａｏ　（Ｃｏｉ／ｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｌｅｎｅｅ　ａ　Ｉｄ　Ｐｈａｒｍａｃｙ．Ｎａｎｉｉｎｇ　Ｕａｌｔ，ｅｔｓｉＷ　ｏ／Ｃｈｅｍｉｃａ／Ｔｅｅｈｒｒａｌｃｇｙ，Ｎ￣ｎｉｌｎｇ　２１０００９）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｈｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｒ｛ａｃｅ　ｍｅｔｈｏｄ（ＲＳＭ）ｗａｓ｛［ｒｓｔｌｙ　ａｐｐｔｉｅｄ∞ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ｔｈｅ∞ｍｐ０ｎｅｎｔｓ　ｏ｛ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｊｕｍ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｓｅＩｅｃｔｅｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　Ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｆｕｍａｒａｓｅ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｂ日ｍ—　。　ｉａｇｅｎｅｓ　ＭＡ－２　ａｎｄ　Ｂ　“ｍ　ＭＡ　３　ｗｅｒｅ　２７　８８×１０　／＊ｍｏｌ／ｇ　ｈ　ａｎｄ　３２　２６×１０　￣ｍｏｌ／ｇ　ｈ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈ　￣，ｖｅｒｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｒｅｐｏｒｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｒｎｅｔｈｏｄ（ＲＳＭ）；ｆｕｍａｒａｓｅ；ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　简　讯　《基因工程实验技术》课件已完成　由上海大学生物工程系王稻源教授主持的计算机辅助教学《基因工程实验技术》课件，目　前已完成的有仿真ＰＣＲ扩增实验技术，仿真ｅＤＮＡ文库实验技术，仿真ＤＮＡ序列测定实验技　术．仿真外源基因在原核和真核表达实验技术共５个课件，井制成光盘：该课件内容除了介绍　实验原理外，最大特点是学生可以在计算机上进行模拟操作，基本上可以达到实验室操作的效　果．而且图像生动，直感性强，有利于学生对实验的理解和掌握。　１２—