一株高产春雷霉素菌株生长特性及其培养基优化

文章编号：1001-86(2019)08-0920-04

一株高产春雷霉素菌株生长特性及其培养基优化

梁剑光1,2 祝金山3,* 赵明霞2,4 栗波2,4 王立梅2

(1 常州大学制药与生命科学学院，常州 2131；2 常熟理工学院生物与食品工程学院，常熟 215500；3 浙江钱江生物化学股份

有限公司，海宁 314400；4 苏州大学药学院，苏州 215123)

摘要：本文从一株高产春雷霉素菌株(CIT-04)出发，对其菌株生长特性(菌形、菌浓)和发酵培养基进行研究。结果表明：菌株CIT-04在种子培养基中的菌形变化随培养时间相关，种子培养33h菌浓(PMV)达25%接种时机最佳。通过对其发酵培养基成分单因素筛选和正交优化试验，确定培养基配方：黄豆饼粉4%、食用豆油2.5%、KH2PO4 0.05%、玉米浆0.1%、NaCl 0.5%、蛋白胨0.5%、麦芽糖3%、蚕蛹粉1%、MgSO4 0.03%，最终高产菌株春雷霉素发酵效价可达到18780U/mL。

关键词：春雷霉素；菌株特性；培养基优化中图分类号：R978.1 文献标志码：A

Growth characteristics and optimization of fermentation medium for a high-yield

kasugamycin producing Streptomyces microaureus

Liang Jian-guang1,2, Zhu Jin-shan3, Zhao Ming-xia2,4, Li Bo2,4 and Wang Li-mei2

(1 College of Pharmaceutical and Life Sciences, Changzhou University,Changzhou 2131; 2 College of Biological and Food

Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500; 3 Zhejiang Qian Jiang Biochemical Limited by Share Ltd, Haining 314400; 4 College of Pharmacy, Suzhou University, Suzhou 215123)

Abstract In this paper, the growth characteristics (the mycelium morphology and pacted mycelium volume) and fermentation medium for a strain of Streptomyces microaureus CIT-04), which produced kasugamycin, were studied. The results indicated that the hypha patterns changed greatly during the cultivation with seed medium. The best inoculate time was 33h when the seed mycelial concentration was 25% PMV. The optimization of the medium was carried out by using the orthogonal analytical method, and the optimum medium components was: soybean cake powder (4%), edible soybean oil (2.5%), KH2PO4 (0.05%), corn starch (0.1%), NaCl (0.5%), peptone (0.5%), maltose (3%), silkworm chrysalis powder (1%), and MgSO4 (0.03%). Under the optimized condition, the titer of kasugamycin produced by CIT-04 was up to 18780U/mL.

Key words Kasugamycin; Strain characteristics; Culture medium optimization

春雷霉素，又称春日霉素，商品名称为加收米，是由肌醇和二基已糖组成的双糖类物质，其化学分子式为C14H25N3O9(图1)，呈弱碱性[1]。春雷霉素由小金色链霉菌(Streptomyces microaureus)在发酵过

收稿日期：2018-10-09

基金项目：苏州市科技项目(No. SNG201618)和常熟市科技项目(No. CN201613和No. CR201704)

作者简介：梁剑光，男，生于1979年，博士，副教授，主要研究方向为微生物发酵及生物催化过程，E-mail: liangjg4523@163.com*

程中分泌产生，在农用和医疗上都具有重要作用，可用于防治革兰阴性菌和革兰阳性菌的感染，医疗上对铜绿假单胞菌的感染治疗上有极好的效果[2]；春雷霉素农业上作农用杀菌剂，对稻瘟病具有突出的防通讯作者，E-mail: qjshzjs@sina.com, E-mail: liangjg4523@163.com

一株高产春雷霉素菌株生长特性及其培养基优化 梁剑光等

图1 春雷霉素分子结构

[1]

Fig. 1 Structures of kasugamycin

效和治疗作用，并对人畜毒性较低，对环境亦无污染作用[3]。目前国内生产厂家较少[4]，其原料主要由延边春雷生物药业有限公司生产，因此，提高春雷霉素菌株的高产特性具有重要现实意义。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 试验菌株

CIT-04菌株由常熟理工学院梁剑光老师实验室提供。

1.1.2 主要培养基

(1)种子培养基(%)：黄豆饼粉1.5，食用豆油1，KH2PO4 0.08，NaCl 0.3，蚕蛹粉0.1，玉米浆0.1，酵母膏0.3，甘油0.6，pH6.7~6.8。(2)初始发酵培养基(%)：黄豆饼粉 3，食用豆油2，KH2PO4 0.05，NaCl 0.3，蛋白胨0.3，麦芽糖2，pH6.6~6.7。1.1.3 主要仪器设备与试剂

恒温培养摇床购于上海世平实验设备有限公司；细菌培养箱购于上海申贤恒温设备厂；低温离心机(H-2050R)购于长沙湘仪离心机仪器有限公司制造；麦芽糖、葡萄糖、碳酸钙、酵母粉、春雷霉素标准品等试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。1.2 实验方法

1.2.1 春雷霉素标准曲线制作

标准品春雷霉素2.0%的水剂为2mg/kg，即相当于2万单位，将标准品稀释成不同的浓度，采用管碟法测定春雷霉素标准品效价，作出标准曲线方程。1.2.2 高产菌株的种子制备

用250mL锥形瓶，装液量30mL，灭菌后在超净台上挑取大小约为0.5cm×0.5cm菌块，接入种子培养基中，于28℃旋转式摇床(240r/min)培养30~36h，菌浓(pacted mycelium volume, PMV)达到15%~20%再接入发酵瓶中。

1.2.3 菌浓(PMV)的测定

取10mL菌液注入10mL有盖离心管内，于冷冻离心机中离心10min(离心转速10000r/min)，再计算压

. 921 .

缩体积与总液体体积比。1.2.4 春雷霉素菌株摇瓶发酵

取250mL锥形瓶，每瓶装液量为30mL，灭菌后在超净台上从种子液中取4.0mL接入发酵瓶中，于28℃旋转式摇床(240~260r/min，湿度45%~49%)培养

168~192h，检测发酵过程中的春雷霉素效价。1.2.5 春雷霉素效价测定(管碟法)

春雷霉素发酵后经过离心，取上清液，将牛津杯至于含枯草芽孢指示菌的双层固体平板上，牛津杯放置应尽量保持间距相等，每个牛津杯加入200μL发酵处理后的上清液(发酵液稀释一定倍数)，将平板放于4℃冰箱1h左右，便于抗菌素扩散。随后，再移入37℃培养箱中培养30h，取出测量抑菌圈大小，利用标准曲线方程计算效价。2 结果与分析

2.1 春雷霉素标准品曲线与效价关系

本实验设计7个浓度梯度，分别是500、750、1000、1250、1500、1750和2000U/mL。采用双层平板(牛津杯法)测定标准品的抑菌圈。主要结果见图2，通过线性拟合，得出春雷霉素标准品抑菌圈直径与效价关系方程：y=0.74x+1.77(R=0.9996)，见图3，数据拟合良好。

2.2 高产菌株CIT-04菌体形态特征与菌体浓度关系

实验设计12组春雷霉素菌株CIT-04种子液，每组3瓶，每隔3h测1次菌浓，结果见表1。从表1可以看出，菌浓PMV在12h之前仅增加1.0%，比较缓慢，但从12h之后，菌浓开始快速增加，而在33h后，菌浓达到25%，36h稍有下降趋势。这说明，种子摇瓶摇床培养较为适合的时间点在第33小时左右，这时根据菌形和菌浓初步判断为该菌种的最佳接种时间。从种子镜检图4中可以看出，培养24h种子液的菌体含量较少，菌体形态与细菌类非常相似，正处于之中，有的呈弯曲或弧形状。培养30和33h种子

浓度(750U/mL) 浓度(1500U/mL)

图2 春雷霉素标准品抑菌圈效果

Fig. 2 The inhibitory zone of kasugamycin standard substance

. 922 .30002700)2400Lm2100/U(1800/效价15001200900600300

011

12

13

14

15

16

17

18

19

20

抑菌圈直径/mm

图3 春雷霉素效价的标准品曲线Fig. 3 Standard titer curve of kasugamycin

表1 种子培养基中菌株CIT-04菌体浓度(PMV)变化情况Tab. 1 PMV of strain CIT-04 cultured at seed stage

t/h

3

6912151821

24

27

30

3336PMV/%8

8

9

9

1214.516.519

21.524

25

24.5

24h30h33h

图4 春雷霉素菌株CIT-04在种子培养中培养时间与菌形变化Fig. 4 Pellets morphology of strain CIT-04 grown at seed stage

液的菌体在镜检视野中数量明显增多，且短杆菌状增多，这与一般放线菌的形态有较大差别。

2.3 春雷霉素菌株CIT-04发酵培养基成分单因素实验2.3.1 发酵培养基中复合碳源对发酵的影响

首先根据文献查阅资料，分别采用麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇进行糖类发酵实验，基础发酵培养基中其他成分不变。第7天测定春雷霉素菌株的发酵效价，结果如表2所示：以麦芽糖作为糖类发酵结果效价最高，其次是蔗糖，葡萄糖最低。因此，麦芽糖是比较适合作为春雷霉素发酵的碳源，与文献报道基本一致。

在此实验基础上，以麦芽糖为基础碳源，再选择食用豆油、玉米油和菜油与麦芽糖组合作为春雷霉素发酵培养基中的复合碳源，在第7天对菌株发酵效价进行测定，结果如表3所示。食用豆油作为与麦芽糖搭配为复合碳源，菌株具有较高的发酵效价，其次是玉米油，综合考虑成本等因素，食用豆油是作为较好的一种碳源。

2.3.2 发酵培养基中几种有机氮源对发酵效价的影响

选用黄豆饼粉、花生饼粉和豆粕粉作为氮源，分

中国抗生素杂志2019年8月第44卷第8期

表2 不同碳源(糖类)对应春雷霉素效价影响

Tab. 2 Titers of kasugamycin produced by CIT-04 grown on

different carbon sources

碳源种类效价/(U/mL)2%麦芽糖12126±1482%蔗糖9385±2222%葡萄糖6674±1852%甘露醇

8333±260

表3 不同油类碳源所对应的春雷霉素效价

Tab. 3 Titers of kasugamycin produced by CIT-04 grown on

different oil sources

碳源种类效价/(U/mL)1.5%食用豆油12978±1481.5%玉米油10400±1851.5%菜油

7918±185

别配制发酵培养基进行发酵效价测定，结果如表4。

因此，黄豆饼粉效果最好，花生饼粉也有明显效果，而豆粕粉的效果较差。因而，有机氮源选择黄豆饼粉较为合适。

2.3.3 发酵培养基中添加Mg2+对效价的影响

在发酵培养基配方添加Ca2+(以CaCl2计)、Mg2+(以MgSO4计)比较发酵效果，其中有一组不添加任何离子作为对照组。实验结果如表5。

由表5结果可知，Mg2+的促进作用是很明显的，Ca2+的添加没有明显影响，从而，可以选择在发酵培养基中选择添加Mg2+从而获得更高的发酵效价。2.3.4 正交设计实验优化发酵培养基

上述筛选出的几种因素：麦芽糖、黄豆饼粉、食用豆油、Mg2+进行正交试验设计L9(34)。正交实验分析如表6所示。

从表7可以看出，极差由大到小排列为：黄豆饼粉>食用豆油>麦芽糖>Mg2+，这说明黄豆饼粉的

表4 不同有机氮源对应春雷霉素效价

Tab. 4 Titers of kasugamycin produced by CIT-04 grown on

different nitrogen sources

氮源种类效价/(U/mL)3%黄豆饼粉11518±1853%花生饼粉10756±148 3%豆粕粉

7918±148

表5 添加金属离子对春雷霉素的效价影响Tab. 5 Effect of metal ions on kasugamycin titer

金属离子效价/(U/mL)0.03% MgSO413660±1560.03% CaCl211518±148不添加

11260±148

一株高产春雷霉素菌株生长特性及其培养基优化 梁剑光等

表6 L9(34)正交试验表头设计

Tab. 6 The orthogonal experimental design [L9(34)]

水平因素

麦芽糖/%

食用豆油/%

黄豆饼粉/%

Mg2+/%12230.02232.0.033

4

3

5

0.04

影响最大，其次分别是食用豆油、麦芽糖、Mg2+

。因此，本实验筛选出的最佳发酵配方为：黄豆饼粉4%、食用豆油2.5%、KH2PO4 0.05%、玉米浆0.1%、NaCl 0.5%、鱼粉蛋白胨0.5%、麦芽糖3.0%、蚕蛹粉1.0%、MgSO4 0.03%。通过摇瓶实验验证后，菌株CIT-04发酵效价达到18780U/mL。3 结论与展望

本文主要对高产菌株CIT-04产春雷霉素种子菌

表7 正交设计实验结果

Tab. 7 The result of orthogonal experimental [L9(34)]

因素麦芽糖/%食用豆油/%黄豆饼粉/%Mg2+/%效价/(U/mL)

实验1111113660实验2122218570实验3133315660实验4212316948实验5223116200实验6231215133实验7313214378实验8321314874实验9332115650

均值115963149951455515713均值2160941681706016027均值31497018411215827极差

1124

1553

2505

314

体形态和发酵培养基进行优化研究，通过本实验最终得出如下结论：种子培养33h菌浓(PMV)达25%接种时机最佳；通过对其发酵培养基成分单因素筛选和正交优化试验，确定培养基配方为：黄豆饼粉4%、食用豆油2.5%、KH2PO4 0.05%、玉米浆0.1%、NaCl 0.5%、蛋白胨0.5%、麦芽糖3%、蚕蛹粉1%、MgSO4 0.03%，最终高产菌株春雷霉素发酵效价可达

. 923 .

到18780U/mL。

春雷霉素作为农用杀菌剂以其高效、低毒、低污染而得到广大用户的喜爱[5-6]。然而，春雷霉素目前国内生产厂家较少，其菌株和工艺有待进一步提升[7]。展望未来，春雷霉素生物合成和基因功能研究已逐渐清晰[8-9]，但产业化和应用推广上还有待扩展，比如春雷霉素对铜绿假单胞菌的感染治疗效果突出，希望能进一步开发成为一种新药投入市场，使患者受益。目前春雷霉素医药价值还未开发，春雷霉素也能有望在医药学上大放光彩。总之，今后对春雷霉素生产工艺而言，进一步选育高产的菌株依然是今后提高产量的关键手段，其次是拓展其应用范围，开发更有价值的春雷霉素衍生物。

参 考 文 献

[1] 朱琛琛, 春雷霉素生物合成及高产菌株改造[D]. 上

海: 上海交通大学, 2016.[2] 汪桂, 吴蕴, 袁子雨, 等. 春雷霉素的研究现状及展望[J].

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kasugamycin. I. acid degradation[J]. J Antibiot, 1965, 18(4):

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[6] Ikeno S, Aoki D, Hamada M, et al. DNA sequencing and

transcriptional analysis of the kasugamycin biosynthetic

gene cluster from Streptomyces kasugaensis M338-M1[J]. J Antibiot (Tokyo), 2006, 59(1): 18-28.

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