检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 111286559 A(43)申请公布日 2020.06.16

(21)申请号 202010150041.4(22)申请日 2020.03.06

(71)申请人 广东海大畜牧兽医研究院有限公司

地址 511400 广东省广州市番禺区沙头街

小平工业区福平路八街5号(72)发明人 李中圣　刘文娜　伍建敏　王凤求　

罗律　张钰薇　曹梦蕊　(74)专利代理机构 广州嘉权专利商标事务所有

限公司 44205

代理人 景鹏　何爽(51)Int.Cl.

C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01)

(54)发明名称

检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒(57)摘要

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒。具体地，所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO:4～5所示的引物对；所述探针包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的探针和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的探针。本发明的试剂盒包括上述引物和探针，通过设置反应抑制对照，可指示核酸提取及PCR过程中可能的PCR反应抑制物，监控PCR扩增质量；本发明试剂盒制造方法简便、兼容常规实时荧光PCR检测设备，在快速荧光PCR设备上可实现“极速扩增”，约20分钟完成PCR检测。CN 111286559 A

权利要求书1页 说明书14页

序列表2页 附图2页

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权　利　要　求　书

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1.一种引物组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO:4～5所示的引物对。

2.一种探针，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的探针和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的探针。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针为自身猝灭探针，其5’端标记有荧光发射基团，3’端标记有荧光猝灭基团。

4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于，所述荧光发射基团选自FAM、CY5、VIC、JOE和HEX；所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA和MGB。

5.一种组合物，包括如权利要求1所述的引物组和如权利要求2至4任一项所述的探针。6.一种试剂盒，包含如权利要求1所述的引物组和/或如权利要求2至4任一项所述的探针。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含无核酸水、实时荧光PCR反应缓冲液、阳性对照品、阴性对照品和反应抑制对照品中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有非洲猪瘟病毒标准毒株基因组的质粒；所述阴性对照品为无核酸水。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述反应抑制对照品为含有人β-globin基因组的质粒。

10.权利要求1所述的引物组、权利要求2至4任一项所述的探针、权利要求5所述的组合物或权利要求6至9任一项所述的试剂盒在制备检测非洲猪瘟病毒的试剂中的应用。

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检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒

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技术领域

[0001]本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒。

背景技术

[0002]非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种高度接触性传染病，临床以高热、皮肤和内脏广泛性出血、神经症状、腹泻、死亡为主要特征。非洲猪瘟病毒(ASFV)是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员。ASFV是一个复杂的二十面体DNA病毒，病毒粒子包含许多同轴心结构，外部有六角形膜，病毒粒子的平均直径大约为200nm。ASFV基因组为双链DNA，大小170～190kb，可编码200多种蛋白质，其中结构蛋白有54种，P72是一种结构蛋白，是病毒衣壳的主要组成部分，P72基因序列保守，不同毒株之间都有相同的保守序列。[0003]目前，针对ASFV的检测技术主要有针对病毒核酸检测技术和基于病毒抗原/抗体反应的免疫学技术。用免疫学方法检测抗体可以了解ASFV感染、发生、发展的进程，但抗体只有在病毒感染至一定时期后才会出现，故ELISA等抗体检测方法存在一定的局限性。PCR、荧光定量PCR、LAMP等分子生物学技术在猪感染ASFVV的早期即可检测到病毒核酸，在ASFV的早期检测中具有重要作用。成熟的PCR检测方法主要选取ASFV的P72基因作为目的基因，根据不同毒株P72基因的高度保守序列设计出引物，抽提样本中病毒的DNA作为模板，建立的PCR方法能够有效的检测出ASFV。然而，现有的各种PCR技术不能消除检测过程中潜在的PCR反应抑制剂对检测结果的影响，或者引入的反应抑制对照品对ASFV检测性能有影响。发明内容

[0004]本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明提供了一种实时、准确、快速，可以检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒。[0005]因此，本发明的第一个目的在于提供一种检测非洲猪瘟病毒的的引物。[0006]本发明的第二个目的在于提供一种检测非洲猪瘟病毒的探针。[0007]本发明的第三个目的在于提供一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒。[0008]本发明所采用的技术方案如下文所述。[0009]本发明的一方面涉及一种引物组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO:4～5所示的引物对。[0010]其中，如SEQ ID NO:1～2所示的引物对可以特异性扩增非洲猪瘟病毒，如SEQ ID NO:4～5所示的引物对可以特异性扩增反应抑制对照体系。上述引物组能够消除检测过程中潜在的PCR反应抑制剂对检测结果的影响，用于检测非洲猪瘟病毒具有灵敏度高、特异性好的优势。

[0011]根据本发明的一些实施方式，如上所述引物可以由本领域常规技术手段合成。[0012]本发明的另一方面涉及一种探针，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的探针和

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核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的探针。

[0013]本发明的探针能够用于检测非洲猪瘟病毒。[0014]根据本发明的一些实施方式，所述探针带有可检测的标记。[0015]根据本发明的一些实施方式，所述探针为自身猝灭探针。[0016]根据本发明的一些实施方式，所述探针的5’端标记有荧光发射基团，3’端标记有荧光猝灭基团。

[0017]根据本发明的一些实施方式，所述荧光发射基团选自FAM、CY5、VIC、JOE和HEX；所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA和MGB。[0018]根据本发明的一些实施方式，如上所述探针可以由本领域常规技术手段合成。[0019]本发明的另一方面还涉及一种组合物，其含有如上所述的引物组和/或如上所述的探针。

[0020]本发明的组合物可用于检测非洲猪瘟病毒，灵敏度高、特异性好。[0021]本发明的另一方面还提供一种试剂盒，包含如上所述的引物对和/或如上所述的探针。

[0022]根据本发明的一些实施方式，所述试剂盒还包含无核酸水、实时荧光PCR反应缓冲液、阳性对照品、阴性对照品和反应抑制对照品。[0023]根据本发明的一些实施方式，所述实时荧光PCR反应缓冲液为PalmTaqTM Multiplex qPCR Master Mix。

[0024]根据本发明的一些实施方式，所述阳性对照品为含有非洲猪瘟病毒标准毒株基因组的质粒。

[0025]本发明试剂盒阳性对照设置为“含有ASFV核酸靶片段的”对照品——以一段线性化ASFV核酸LpdB646L作为阳性对照，在扩增过程中用来指示Real-time PCR扩增质量，阳性对照品为一段线性化ASFV核酸，不含抗性基因，生物安全性符合要求。[0026]根据本发明的一些实施方式，所述阴性对照品为无核酸水。[0027]本试剂盒将阴性对照品设置为“无外源核酸的”对照品——以无核酸(DEPC)水作为对照，阴性对照参与核酸提取及Real-time PCR全过程，用来监控核酸提取及PCR扩增过程引入的污染。

[0028]根据本发明的一些实施方式，所述反应抑制对照品为含有人β-globin基因组、人RhoG基因组、人ACTB基因组、人GAPD基因组或人RPS18基因组的质粒。优选地，所述反应抑制对照品为含有人β-globin基因组的质粒。

[0029]本发明为消除检测过程中潜在的PCR反应抑制剂对检测结果的影响，试剂盒设置了PCR反应抑制对照品(IC)，该对照品参与待检样品核酸提取和PCR全过程，在检测中，通过限定或分析IC的数值，判断PCR反应体系的扩增效率及有效性，排除PCR反应抑制物对检测结果的影响并可为检测改进提供数据支撑。本发明通过大量研究对构建的双重实时荧光PCR条件进一步优化、测试，使得反应抑制对照品(IC)的引入不影响ASFV检测性能。

[0030]本发明的试剂盒能够消除检测过程中潜在的PCR反应抑制剂对检测结果的影响，可用于检测非洲猪瘟病毒，灵敏度高、特异性好。所用引物和探针可特异性识别各种已报道的ASFV毒株，并通过大量试验评估了试剂盒与OIE推荐检测法相比较的特异性和灵敏度等。在本试剂盒的特异性研究中，选取常见14种猪病原进行验证，结果证明针对“干扰”病原核

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酸的检测均为阴性。针对1000份临床样本检测，与标准的ASFV检测法均一致。

[0031]本发明的另一方面还涉及一种非诊断或治疗目的检测非洲猪瘟病毒的方法，包括使用如上所述的引物组、如上所述的探针、如上所述的组合物或如上所述的试剂盒的步骤。[0032]根据本发明的一些实施方式，所述非诊断或治疗目的检测非洲猪瘟病毒的方法，包括下述步骤：

[0033]1)取待检样品，加入反应抑制对照品后，提取核酸；[0034]2)进行实时荧光PCR反应；[0035]3)判断待检样品；

[0036]上述方法不用于疾病的诊断和治疗。[0037]根据本发明的一些实施方式，步骤2)中，所述实时荧光PCR的反应体系为：

[0038]

根据本发明的一些实施方式，步骤3)中，判断待检样品的过程为：[0040]S1.有效性判定

[0041]阳性对照在FAM和Cy5通道均有典型扩增曲线，且Ct≤30；阴性对照在FAM通道无扩增曲线或Ct＝0，在Cy5通道有典型扩增曲线，且Ct≤30；阴性对照中Cy5通道Ct值比阳性对照中Cy5通道Ct值稍大或相当，差值不超过3。同时满足以上三个条件则判定实验成立，否则实验结果无效，需重新检测；[0042]S2.结果判定[0043](1)被检样品在FAM和Cy5通道均有典型扩增曲线，FAM通道Ct≤38，Cy5通道Ct≤30，可判定为ASFV核酸阳性“+”；[0044](2)被检样品在FAM通道无扩增曲线或Ct＝0，Cy5通道有典型扩增曲线，且Ct≤30，可判定为ASFV核酸阴性“-”；[0045](3)被检样品在FAM和Cy5通道有典型扩增曲线，FAM通道Ct＞38，Cy5通道Ct≤30，可判定为可疑，建议重新采样进行检测。[0046]本发明将阴性对照的Ct值、阳性对照的Ct值和反应抑制对照的Ct值，三个约束条件基本判断试剂盒质量情况、核酸提取方法合理性及扩增效率；首先阴性对照和阳性对照

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结果成立(FAM通道结果)，反应抑制对照因参与核酸提取的损失在Ct值(Cy5通道结果)的差异上不能大于3——不超过一个数量级内的损失。阴阳性对照品结果及PCR反应抑制对照的数值差，结合实验室条件等因素，可为专业技术人员排除检测不利因素提供数据支撑。重复试验统计分析表明，靶基因的浓度为10°Copies/μL时，Ct≤38的置信度大于95％。综合行业ASFV核酸检测判定方法及设备差异情况，将ASFV检测时，FAM通道Ct≤38作为阳性判定标准。经本研究构建的双重实时荧光PCR优化及大量样本测试，IC反应抑制对照在参与核酸提取后在不同设备Cy5通道检测结果均Ct≤30，Cy5通道Ct＞30提示反应体系中存在较高PCR反应抑制物，须重新检测。

[0047]本发明的另一方面还涉及如上所述的引物组、如上所述的探针、如上所述的组合物或如上所述的试剂盒在制备检测非洲猪瘟病毒的试剂中的应用。[0048]本发明的有益效果：

[0049]本发明以非洲猪瘟病毒B646L(p72)基因的保守序列为靶基因，设计非洲猪瘟病毒特异的引物和探针，并以人β-globin检测体系为反应抑制对照，应用双重实时荧光PCR法检测样品中非洲猪瘟病毒核酸。

[0050]本发明试剂盒经大量临床样品验证，试剂盒对低至1拷贝/微升的样品有极高的检出率，敏感性高；对常见临床针状类似的疫病无交叉反应，特异性强；检测性能符合ASFV防控需求；试剂盒设置“反应抑制对照”，可指示核酸提取及PCR过程中可能的PCR反应抑制物，监控PCR扩增质量；本发明试剂盒制造方法简便、兼容常规实时荧光PCR检测设备，在快速荧光PCR设备上可实现“极速扩增”——约20分钟完成PCR检测。附图说明

[0051]图1为pMD18-dB646L双酶切结果图；[0052]图2为pMD18-dβ-globin双酶切结果图；[0053]图3为实时荧光PCR扩增图。

具体实施方式

[0054]以下结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0055]实施例1引物和探针设计

[0056]本发明人以非洲猪瘟病毒B646L(p72)基因的保守序列为靶基因，设计非洲猪瘟病毒特异的引物探针；根据GenBank中人β-globin基因序列，选取保守区部分基因序列，设计反应抑制对照的特异性引物探针。经过体系优化(组分优化和程序优化)，从大量组合中筛选出了与本发明试剂盒所用酶及缓冲体系为最佳搭配——引物、探针及扩增片段中GC含量及组成与DNA聚合酶的偏好性一致，可在达到最佳扩增效率的同时保证扩增的特异性；如表1所示，为本发明筛选出的实时荧光RT-PCR引物和探针，其中，ASFV的引物和探针序列分别为AS-real-F2(SEQ ID NO:1)、AS-real-R2(SEQ ID NO:2)和AS-real-probe(SEQ ID NO:3)；β-globin的引物和探针序列分别为IC-F(SEQ ID NO:4)、IC-R(SEQ ID NO:5)和IC-P(SEQ ID NO:6)；由上海百力格生物技术有限公司合成，2OD/管，干粉。

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表1实时荧光RT-PCR引物和探针

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实施例2非洲猪瘟病毒试剂盒的组装及使用方法

[0060]试剂盒由pASFV PCR反应液A(特异性引物和特殊修饰的荧光探针，用于特异性结合目的核酸片段)、pASFV PCR反应液B(热启动DNA聚合酶用于目的核酸片段的扩增)、阴性对照(无外源核酸的DEPC水，参与核酸提取及PCR过程，用于监控检测全程是否引入污染)、阳性对照(一段线性化的核酸片段LpdB646L，不含抗性基因，无抗性污染和生物危害性，用于指示PCR过程是否成立)反应抑制对照(一段线性化的核酸片段Lpdβ-globin，无抗性污染和生物危害性，符合生物安全要求，参与核酸提取及PCR过程，用于监控检测全程是否存在PCR反应抑制物)和说明书(试剂盒的名称、检测原理、用途、组分、用法、结果判定、注意事项、规格、贮藏和有效期等)组成，各组分名称和装量见表2。[0061]表2试剂盒各组分名称和装量表

[0062]

说明书中包括试剂盒的制备方法和使用方法

[0064]1.制备方法[0065]1.1pASFV PCR反应液A的制备[0066]ASFV和β-globin的引物、探针序列分别为：AS-real-F2、AS-real-R2、AS-real-probe和IC-F、IC-R、IC-P，序列及标记见表1，委托上海百力格生物技术有限公司合成，2OD/管，干粉。用DEPC水将引物AS-real-F2、AS-real-R2、IC-F、IC-R稀释至浓度为10μM，探针AS-real-probe、IC-P稀释至浓度为5μM。按表3所示进行混合、分装，600μL/管，-20℃以下保存。[0067]表3试剂盒中pASFV PCR反应液A各组分用量

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1.2pASFV PCR反应液B的制备

[0070]购买商品化的PalmTaqTM Multiplex qPCR Master Mix，直接分装，300μL/管，-20℃以下保存。

[0071]1.3阴性对照的制备[0072]购买商品化DEPC水，直接分装，1800μL/管，-20℃以下保存。[0073]1.4阳性对照的制备[0074]根据GenBank中ASFV B646L基因序列，经分析比对后选取基因片段上保守区部分基因序列(SEQ ID NO:7)，进行人工合成；构建至pMD18T载体中，获得质粒载体命名为pMD18-dB646L，将其转化至DH5α感受态细胞后挑选阳性克隆提取质粒，经酶切鉴定和测序分析，表明构建成功；将阳性重组大肠杆菌命名为DH5α/pMD18-dB646L(代号ASP1)；将ASP1接种于LB液体培养基中(含50μg/mL氨苄青霉素)，37℃下震荡培养12h；培养物8000rpm离心10min，弃上清，沉淀用PBS洗涤2次，按质粒提取试剂盒(OMEGA)操作说明进行质粒提取，测定质粒浓度为360ng/μL，即1.12×1010copies/μL；取1μg质粒用限制性内切酶Sac I和Bsa I进行酶切，37℃孵育6h，对线性化产物进行凝胶电泳，用胶回收试剂盒(OMEGA)对大小约2542bp的片段回收，得到线性化的质粒命名为：LpdB646L，测定浓度为168ng/μL，即6.03×1010copies/μL；用1×TE buffer将LpdB646L稀释至105copies/μL，分装，50μL/管，-20℃以下保存。

[0075]如图1所示，为pMD18-dB646L双酶切结果图；其中，泳道M为DNAmarker，泳道P为质粒pMD18-dB646L，泳道L为双酶切图，其中3000bp大小为线性化核酸片段LpdB646L。[0076]1.5反应抑制对照的制备[0077]根据GenBank中人β-globin基因序列，经分析比对后选取保守区部分基因序列(SEQ ID NO:8)，进行人工合成；构建至pMD18T载体中，获得质粒载体命名为pMD18-dβ-globin，将其转化至DH5α感受态细胞后挑选阳性克隆提取质粒，经酶切鉴定和测序分析，表明构建成功；将阳性重组大肠杆菌命名为DH5α/pMD18-dβ-globin(代号HbG1)；将HbG1接种于LB液体培养基中(含50μg/mL氨苄青霉素)，37℃下震荡培养12h；培养物8000rpm离心10min，弃上清，沉淀用PBS洗涤2次，按质粒提取试剂盒(OMEGA)操作说明进行质粒提取，测定质粒浓度为400ng/μL，即1.24×1011copies/μL；取1μg质粒用限制性内切酶Sac I和Bsa I进行酶切，37℃孵育6h，对线性化产物进行凝胶电泳，用胶回收试剂盒(OMEGA)对大小约2537bp的片段回收，得到线性化的质粒命名为：Lpdβ-globin，测定浓度为193ng/μL，即6.94

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×1010copies/μL；用1×TE buffer将Lpdβ-globin稀释至106copies/μL，分装，100μL/管，-20℃以下保存。

[0078]如图2所示，为pMD18-dβ-globin双酶切结果图；其中，泳道M为DNAmarker，泳道P为质粒pMD18-dβ-globin，泳道L为双酶切图，其中3000bp大小为线性化核酸片段Lpdβ-globin。

[0079]2.使用方法

[0080]2.1核酸提取(在核酸提取区进行)[0081]取200μL处理过的待检样品上清，加入2μL反应抑制对照，按商品化病毒核酸提取试剂盒(柱式/磁珠法)说明提取样品核酸。为控制核酸提取过程潜在的污染，阴性对照参与核酸提取过程，即取100μL阴性对照加入2μL反应抑制对照，再加入生理盐水或PBS至200μL，按病毒核酸提取试剂盒说明提取核酸，故单次核酸提取量为N+1(N为待检样品数)。[0082]2.2试剂配制(在反应体系配制区进行)[0083]从试剂盒中取出pASFV PCR反应液A和pASFV PCR反应液B，恢复至室温后振荡混匀、瞬时离心。按N+2个(再增加1个阳性对照样品)反应计算分别移取pASFV PCR反应液A(12μL/反应)和pASFV PCR反应液B(6μL/反应)至EP管中，振荡混匀、瞬时离心。取N+2个PCR管均加入18μL配置好的反应液(pASFV PCR反应液A+pASFV PCR反应液B)，按序加入提取好的核酸(包括阴性对照)各2μL，在阳性对照管中加入2μL阳性对照和2μL反应抑制对照，各管振荡混匀、瞬时离心、封口，置于荧光PCR仪中。

[0084]2.3实时荧光PCR扩增(在PCR扩增区进行)[0085]选择FAM和Cy5通道，设置如下反应程序：95℃2min；95℃5s，56℃15s(收集荧光信号)，45个循环，在超速实时荧光PCR仪(Ultra-fast Real-time PCR System,Ahram Biosystem,Inc.)上约20min完成扩增。[0086]2.4结果判定[0087]2.4.1有效性判定

[0088]阳性对照在FAM和Cy5通道均有典型扩增曲线，且Ct≤30；阴性对照在FAM通道无扩增曲线或Ct＝0，在Cy5通道有典型扩增曲线，且Ct≤30；阴性对照中Cy5通道Ct值比阳性对照中Cy5通道Ct值稍大或相当，差值不超过3。同时满足以上三个条件则判定实验成立，否则实验结果无效，需重新检测。[0089]2.4.2结果判定[0090](1)被检样品在FAM和Cy5通道均有典型扩增曲线，FAM通道Ct≤38，Cy5通道Ct≤30，可判定为ASFV核酸阳性“+”；[0091](2)被检样品在FAM通道无扩增曲线或Ct＝0，Cy5通道有典型扩增曲线，且Ct≤30，可判定为ASFV核酸阴性“-”；[0092](3)被检样品在FAM和Cy5通道有典型扩增曲线，FAM通道Ct＞38，Cy5通道Ct≤30，可判定为可疑，建议重新采样进行检测。[0093]实施例3试剂盒性能测定[0094]1.特异性

[0095]选用实施例2制备得到的3个批次非洲猪瘟病毒实时荧光PCR核酸检测试剂盒在常规实时荧光PCR仪(ABI Q7)及快速荧光PCR仪(Ahram PLAM)上分别对猪常见14种病原进行

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ASFV核酸检测，验证检测试剂盒对靶标序列识别的特异性。根据病原和临床症状的相似性选择5种病原核酸：(1)猪瘟病毒(CSFV)、(2)猪伪狂犬病毒(PRV)、(3)猪圆环病毒2(PCV2)、(4)猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)和(5)猪流行性腹泻病毒(PEDV)作为试剂盒特异性质控品(AS/QC/N1～5)。特异性试验结果如表4和表5所示，可以看出，针对质控样品检测结果均为阴性。

[0096]表4试剂盒特异性检验结果(ABI Q7)

[0097]

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[0098]

[0099][0100]

注：“-”表示结果为阴性

表5试剂盒特异性检验结果(Ahram PLAM)

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[0102]

注：“+”表示结果为阳性；“-”表示结果为阴性

[0104]2.重复性

[0105]重复性试验均在ABI Q7设备上测试，PCR反应程序：95℃，2min；95℃，5s；56℃，15s，45Cycles。

[0106]2.1批内重复性试验

[0107]随机从批次1实验室产品中抽取4个试剂盒，命名为：RTK1～4，进行批内制品的重

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[0103]

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复性测试。按照实施例2中说明书记载的方法来检测灵敏度(敏感性)质控样品。阴性对照(NC)不做核酸提取直接加IC，阳性对照参照说明书操作。通过分析ASFV核酸浓度为101Copies/μl样品的检测结果，计算变异系数(CV)。

[0108]按照试剂盒说明书检测灵敏度(敏感性)质控样品，试剂盒灵敏度检验合格，针对两个浓度的质控样品检测CV＜3％，批内试剂盒重复性良好。[0109]2.2批间重复性试验

[0110]随机抽取4个不同批次试剂盒，进行批间制品的重复性测试。按照实施例2试剂盒说明书检测灵敏度(敏感性)质控样品。阴性对照(NC)不做核酸提取直接加IC，阳性对照参照说明书操作。通过分析ASFV核酸浓度为101Copies/μl样品的检测结果，计算变异系数(CV)。

[0111]按照按照试剂盒说明书检测灵敏度(敏感性)质控样品，结果试剂盒灵敏度检验合格，针对两个浓度的质控样品检测CV＜3％，批间试剂盒重复性良好。[0112]3稳定性

[0113]稳定性试验均在ABI Q7设备上测试，PCR反应程序：95℃，2min；95℃，5s；56℃，15s，45Cycles。

[0114]3.1不同保存条件稳定性研究[0115](1)取-20℃保存的3批试剂盒，分别在保存1、2、3、4、5、6个月时进行灵敏度(敏感性)检验。

[0116]结果显示，试剂盒灵敏度检验合格，针对两个浓度的质控样品检测CV＜3％，试剂盒-20℃保存稳定性良好。[0117](2)取4℃保存的3批试剂盒，分别在保存1、2、3、5、7天时进行灵敏度(敏感性)检验。

[0118]结果显示，试剂盒灵敏度检验合格，针对两个浓度的质控样品检测CV＜3％，试剂盒4℃保存1周灵敏度仍可保证。[0119](3)取37℃保存的3批试剂盒，分别在保存3、6、9、12小时后进行灵敏度(敏感性)检验。

[0120]结果显示，试剂盒灵敏度检验合格，针对两个浓度的质控样品检测CV＜3％，试剂盒37℃保存12小时灵敏度仍可保证。

[0121]3.2反复冻融对试剂盒稳定性影响[0122]以3批试剂盒为测试对象，检验反复冻融对试剂盒稳定性影响，以“-20℃冻存6h，室温解冻1h”作为1次冻融，分别对3个批次试剂盒各冻融3次、5次和10次，进行灵敏度(敏感性)检验。

[0123]结果显示，试剂盒灵敏度检验合格，针对两个浓度的质控样品检测CV＜3％，试剂盒反复冻融10次以内灵敏度仍可保证。[0124]4.不同实验室比对试验[0125]按照比对试验要求，随机抽取3个不同批次试剂盒(批次为SY1902、SY1903和SY1905)在3个不同实验室间比对试验，比对试验样品包括30份比对样品和2份已知ASFV核酸阳性样品(比对实验室提供)。

[0126]分别用3个批次试剂盒检测32份样品，3家实验室针对30份比对样品及2份已知样

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品检验结果均正确，不同实验人员在不同地点、时间检测结果完全一致。比对试验发现，不同设备对靶基因检测的Ct值(扩增效率接近1的最小值及结合基线分析拟合的权重)略有差异，但这一因素不影响阴阳性临界值判断。

[0127]本研究通过一系列试验测试了试剂盒的重复性和稳定性。包括：(1)选择4个批次试剂盒进行批间重复性测试(敏感性检验)；(2)随机抽取一个批次实验室制品，进行批内重复性测试。重复性检验结果显示，批内和批间试剂盒检验的变异系数低于3％，具有较高的重复性。此外，本研究检验了试剂盒不同保存条件的稳定性和反复冻融对检测结果的影响，初步确立、验证了试剂盒的保藏使用条件等。本研究按要求开展了不同检测机构比对试验，用3批次试剂盒进行比对试验的检测结果均一致，不同人员不同试验条件对试剂盒检测结果无显著影响。

[0128]实施例4反应抑制对照品对于试剂盒灵敏度有无影响的判定

[0129]分别以阳性质粒和ASFV阳性脾组织核酸(经绝对定量的)作为测试参照，每个浓度做6个重复测试，结果如表6所示，可以看出反应抑制对照检测体系的加入不影响检测的灵敏度(100copies/μL)。

[0130]表6反应抑制对照对试剂盒性能的影响

[0131]

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CN 111286559 A[0132]

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实施例5RT-PCR设备兼容性的优化

[0134]以拷贝数为105、104、101和100Copies/μL的pMD18-dB646L及拷贝数为106Copies/μL的pMD18-dβ-globin为参考样(以105Copies/μL的pMD18-dB646L样品为阳性对照PC；以DEPC水为阴性对照NC，实验中106Copies/μL的IC对照品分别加入到PC和NC中测试)，参照实施例2配制反应体系及进行PCR扩增，分别在ABI 7500、ABI Q5、ABI Q7和PLAM快速PCR仪上对比、验证优化的检测方法。PCR扩增条件分别为：ABI 7500(95℃，2min；95℃，5s；56℃，32s(此设备限定此处最短32秒)，45cycles)，ABI Q5和ABI Q7(95℃，2min；95℃，5s；56℃，15s，45cycles)；PLAM快速PCR仪(95℃，2min；95℃，5s；56℃，15s，45c ycles)。结果如表7所示，可以看出，PLAM快速体系检测与ABI 7500，ABI Q5和ABI Q7的扩增效果相同，针对低浓度样本检测的效果完全一致。PLAM机器操作简单，可在20分钟内完成PCR检测。[0135]表7不同设备对优化试剂的兼容性试验

[0133]

[0136]

[0137][0138][0139]

*注：“-”为无扩增曲线或Ct值为0，即结果为阴性。“NT”未检验，PCR模板中未加IC。实施例6非洲猪瘟病毒检测试剂盒应用实例

对疑似ASFV感染的拭子应用本发明非洲猪瘟病毒实时荧光PCR核酸检测试剂盒快

速诊断

某地邮寄过来疑似ASFV感染的待检拭子样品一份，在样品制备区，加1ml生理盐

水，充分震荡混匀；在核酸提取区，取200μL上清，加2μL反应抑制对照，按病毒核酸提取试剂盒(购于QIAGEN)说明提取样品核酸。同时阴性对照参与核酸提取过程，即取100μL阴性对照加入2μL反应抑制对照，再加入生理盐水至200μL，同上操作；在反应体系配置区，从试剂盒中取出pASFV PCR反应液A和pASFV PCR反应液B，恢复至室温后振荡混匀、瞬时离心。按3个

[0140]

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反应计算分别移取pASFV PCR反应液A 36μL和pASFV PCR反应液B 18μL至EP管中，振荡混匀、瞬时离心。取3个PCR管均加入18μL配置好的反应液，按序加入提取好的待检样品核酸、阴性对照核酸各2μL，在阳性对照管中加入2μL阳性对照和2μL反应抑制对照，各管振荡混匀、瞬时离心、封口，置于荧光PCR仪中；在PCR扩增区，选择FAM和Cy5通道，设置如下反应程序：95℃2min；95℃5s，56℃15s(收集荧光信号)，45个循环，在超速实时荧光PCR仪(Ultra-fast Real-time PCR System,Ahram Biosystem,Inc.)上约20min完成扩增。[0141]如图3所示，为实时荧光PCR扩增图；可以看出，阳性对照(FAM：Ct＝19.86，Cy5：Ct＝22.73)、阴性对照(FAM：Ct＝0，Cy5：Ct＝23.37)、待检样品(FAM：Ct＝31.78，Cy5：Ct＝23.36)，在阴、阳性对照成立的条件下，可判定待检拭子样品为ASFV核酸阳性“+”，检测结果仅供临床参考，不单独作为疾病确诊依据，需结合更多临床诊断进行疾病确诊。[0142]本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。

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SEQUENCE LISTING<110> 广东海大畜牧兽医研究院有限公司<120> 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒<130> 111<160> 8<170> PatentIn version 3.5<210> 1<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 1tgggccayca tatattgg 18<210> 2<211> 18<212> DNA<213> 人工序列（Artificial Sequence）<400> 2ggatctacaa gcgtgtaa 18<210> 3<211> 21<212> DNA<213> 人工序列（Artificial Sequence）<400> 3ctggcaggat gctccgattc a 21<210> 4<211> 21<212> DNA<213> 人工序列（Artificial Sequence）<400> 4aagtgctcgg tgcctttagt g 21<210> 5<211> 23<212> DNA<213> 人工序列（Artificial Sequence）<400> 5gtcccataga ctcaccctga agt 23<210> 6<211> 25

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序　列　表

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<212> DNA<213> 人工序列（Artificial Sequence）<400> 6cctggctcac ctggacaacc tcaag 25<210> 7<211> 166<212> DNA<213> African swine fever virus<400> 7tgggccatca tatattgggt gcatgtcatt catcctggca ggatgctccg attcagggca 60cgtcccagat gggggcccat gggcagcttc aaacgtttcc tcgcaacgga tatgactggg 120acaaccaaac acccttagag ggcgccgttt acacgcttgt agatcc 166<210> 8<211> 245<212> DNA<213> Human beta-globin<400> 8tcctgatgct gttatgggca accctaaggt gaaggctcat ggcaagaaag tgctcggtgc 60ctttagtgat ggcctggctc acctggacaa cctcaagggc acctttgcca cactgagtga 120gctgcactgt gacaagctgc acgtggatcc tgagaacttc agggtgagtc tatgggaccc 180ttgatgtttt ctttcccctt cttttctatg gttaagttca tgtcatagga aggggataag 240taaca 245

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图1

图2

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图3

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