猫传染性腹膜炎病毒检测用引物组和试剂盒及其检测方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 1035029 A(43)申请公布日 2017.02.22

(21)申请号 201610980709.1(22)申请日 2016.11.08

(71)申请人 黑龙江八一农垦大学

地址 163319 黑龙江省大庆市高新区新风

路5号(72)发明人 孙东波　刘秋瑾　郭东华　武瑞　

王建发　贺显晶　李春秋　(74)专利代理机构 北京英创嘉友知识产权代理

事务所(普通合伙) 11447

代理人 耿超　王浩然(51)Int.Cl.

C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01)

()发明名称

猫传染性腹膜炎病毒检测用引物组和试剂盒及其检测方法(57)摘要

本公开提供了猫传染性腹膜炎病毒检测用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1-4所示的引物。本公开还提供了猫传染性腹膜炎病毒的检测方法和试剂盒。通过上述技术方案本公开建立了新的猫传染性腹膜炎病毒的检测技术，能够实现现有检测技术所无法完成的快速、特异、敏感的结果判定，显著提高了对猫传染性腹膜炎病毒的检测效率，利用该方法获得的作为中间结果的信息的效率、准确性和可靠性高，为尽早发现和有效防控猫传染性腹膜炎病毒提供了重要的技术支持。CN 1035029 A

权利要求书1页 说明书6页序列表1页 附图3页

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权　利　要　求　书

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1.一种猫传染性腹膜炎病毒检测用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1-4所示的引物。

2.一种猫传染性腹膜炎病毒的检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)提取待测样本的总RNA；

(2)对所述总RNA进行逆转录获得PCR模板；用SEQ ID NO.1-2所示的引物对所述PCR模板进行第一PCR扩增，获得第一扩增产物；

(3)以所述第一扩增产物为模板，用SEQ ID NO.3-4所示的引物进行第二PCR扩增，获得第二扩增产物；

(4)对所述第二扩增产物进行核酸电泳检测，得到核酸电泳检测的结果。3.根据权利要求2所述的检测方法，其中，步骤(2)逆转录所使用的逆转录引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其中，SEQ ID NO.1-2所示的引物的最终使用浓度各自为0.3-0.5pmol/μL，SEQ ID NO.3-4所示的引物的最终使用浓度各自为0.3-0.5pmol/μL。

5.根据权利要求2-4中任意一项所述的检测方法，其中，所述第一PCR扩增和所述第二PCR扩增的反应程序为：

6.根据权利要求2-4中任意一项所述的检测方法，其中，所述核酸电泳检测包括核酸凝胶电泳和/或核酸毛细管电泳。

7.一种猫传染性腹膜炎病毒检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1所述的引物组。

8.权利要求1所述的引物组在制备检测猫传染性腹膜炎病毒的试剂盒中的用途。

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猫传染性腹膜炎病毒检测用引物组和试剂盒及其检测方法

技术领域[0001]本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种猫传染性腹膜炎病毒检测用引物组和试剂盒及其检测方法。

背景技术[0002]猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis viruses，FIPV)为不分节段、单股正链RNA病毒，属尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)，冠状病毒属(Coronavirus)，α冠状病毒-1种(Alphacoronavirus-1)。该病毒引起的疾病为猫传染性腹膜炎(Feline infectious peritoniti，FIP)，该疾病以腹膜炎、大量腹水聚积和高致死率为特征。FIP呈地方性流行，虽然发病率较低、多为隐性感染，但其病死率几乎高达100％，相当于猫病中的“艾滋病”。[0003]目前国内临床诊断FIP的方法包括病理学检查、血清学检测和RT-PCR检测等。仅通过临床症状进行诊断的方法，需要依赖于临床症状的表现以及诊断者的经验，而患传染性腹膜炎的猫初期症状不明显，病程进展有较大差异，导致获得的结果容易不准确，往往因误诊而贻误治疗最终导致病猫死亡。现有的常规RT-PCR方法是抽取腹腔液提取RNA后进行RT-PCR检测，这种方法本身的敏感性极低，而同时由于FIPV在腹腔液中含量极少，非常容易导致漏检，从而不能准确检测出FIPV。[0004]因此现有的猫传染性腹膜炎病毒的检测手段存在漏检率高、敏感性低的缺陷，无法实现对病毒的快速准确检测。

发明内容[0005]本公开的目的是克服现有的猫传染性腹膜炎病毒检测手段中存在的上述缺陷，提供一种新的猫传染性腹膜炎病毒检测用引物组和方法。[0006]为达到以上目的，本公开第一方面：提供一种猫传染性腹膜炎病毒检测用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1-4所示的引物。[0007]本公开第二方面提供了一种猫传染性腹膜炎病毒的检测方法，该方法包括如下步骤：[0008](1)提取待测样本的总RNA；[0009](2)对所述总RNA进行逆转录获得PCR模板；用SEQ ID NO.1-2所示的引物对所述PCR模板进行第一PCR扩增，获得第一扩增产物；[0010](3)以所述第一扩增产物为模板，用SEQ ID NO.3-4所示的引物进行第二PCR扩增，获得第二扩增产物；[0011](4)对所述第二扩增产物进行核酸电泳检测，得到核酸电泳检测的结果。[0012]本公开第三方面提供一种猫传染性腹膜炎病毒检测试剂盒该试剂盒包括本公开第一方面所述的引物组。[0013]本公开的第四方面还提供了本公开第一方面所述的引物组在制备检测猫传染性

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腹膜炎病毒的试剂盒中的用途。[0014]通过上述技术方案本公开建立了新的猫传染性腹膜炎病毒的检测引物组和方法，能够实现现有检测技术所无法完成的快速、特异、敏感的结果判定，显著提高了对猫传染性腹膜炎病毒的检测效率，利用该方法获得的作为中间结果的信息的效率、准确性和可靠性高，为尽早发现和有效防控猫传染性腹膜炎病毒提供了重要的技术支持。[0015]本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明[0016]附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的。在附图中：[0017]图1是实施例1中第一扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果；[0018]其中，M：DL2000；1：空白对照；2-7：第一扩增产物。[0019]图2是实施例1中第二扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果；[0020]其中，M：DL2000；1：空白对照；2-7：第二扩增产物。[0021]图3是实施例2中敏感性测试的检测结果；[0022]其中，M：DL2000；1：空白对照；2-14：依次为模板浓度1.363×102ng/μL至1.363×10-10ng/μL的RNA的第一扩增产物。[0023]图4是实施例2中敏感性测试的检测结果；[0024]其中，M：DL2000；1：空白对照；2-14：依次为模板浓度1.363×102ng/μL-1.363×10-10

ng/μL的RNA的第二扩增产物。[0025]图5是实施例3中特异性测试的检测结果；[0026]其中，M：DL2000；1：FIPV标准毒株；2：犬冠状病毒(CCoV)；3：猪流行性腹泻病毒(PEDV)；4：空白对照。具体实施方式[0027]以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于本公开。[0028]一种猫传染性腹膜炎病毒检测用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1-4所示的引物。[0029]在所述引物组中，SEQ ID NO.2所示的引物可以作为逆转录引物对待测样本的总RNA进行逆转录从而获得cDNA模板。[0030]其中，SEQ ID NO.1-2所示的引物构成第一引物对，第一引物对能够特异性的扩增FIPV标准毒株的一段基因序列，获得片段长度为685bp的第一扩增产物。[0031]其中，SEQ ID NO.3-4所示的引物构成第二引物对，第二引物对能够以所述第一扩增产物为模板，特异性的扩增获得片段长度为380bp的第二扩增产物。[0032]本发明还提供了一种猫传染性腹膜炎病毒的检测方法，该方法包括如下步骤：[0033](1)提取待测样本的总RNA；[0034](2)对所述总RNA进行逆转录获得PCR模板；用SEQ ID NO.1-2所示的引物对所述PCR模板进行第一PCR扩增，获得第一扩增产物；

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(3)以所述第一扩增产物为模板，用SEQ ID NO.3-4所示的引物进行第二PCR扩增，

获得第二扩增产物；[0036](4)对所述第二扩增产物进行核酸电泳检测，得到核酸电泳检测的结果。[0037]在本公开中，当核酸电泳检测的结果显示第二扩增产物中具有长度为380bp的条带时，可以判定待测样本中存在猫传染性腹膜炎病毒。如果没有，则判定待测样本中不存在猫传染性腹膜炎病毒。[0038]其中，步骤(1)中可以采用本领域公知的RNA提取方法，例如RNA提取试剂盒，获得待测样本的总RNA。所述待测样本可以包括但不限于病毒、食品、排泄物、呕吐物、血液、腹腔液、组织和细胞培养物等。在本公开的一种实施方式中，所述待测样本为腹腔液。[0039]可选的，步骤(2)逆转录所使用的逆转录引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。相比于使用随机引物，以SEQ ID NO.2所示的序列作为逆转录引物能够提高检测结果的特异性。[0040]在本公开的一种实施方式中，所述第一PCR扩增的体系为：PCR模板3μL，2×premix 12.5μL，上游引物(SEQ ID NO.1)1μl，下游引物(SEQ ID NO.2)1μL，加ddH2O至25μL体系。[0041]其中，在第一PCR扩增中SEQ ID NO.1-2所示的引物的最终使用浓度各自为0.3-0.5pmol/μL。[0042]所述第一PCR扩增的反应程序为：

[0043]

在本公开的一种实施方式中，所述第二PCR扩增的体系为：第一扩增产物3μL，2×premix 12.5μL，上游引物(SEQ ID NO.3)1μl，下游引物(SEQ ID NO.4)1μL，加ddH2O至25μL体系。[0045]其中，在第二PCR扩增中SEQ ID NO.3-4所示的引物的最终使用浓度各自为0.3-0.5pmol/μL。[0046]所述第二PCR扩增的反应程序为：

[0044]

[0047]

[0048][0049]

可选的，所述核酸电泳检测包括核酸凝胶电泳和/或核酸毛细管电泳。

本公开的一个方面还提供了一种猫传染性腹膜炎病毒检测试剂盒，该试剂盒包括

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本公开所述的引物组。[0050]所述试剂盒还可以含有RNA提取试剂、逆转录试剂、PCR反应试剂以及阳性对照和阴性对照中的至少一种。[0051]本公开还提供了所述引物组在制备检测猫传染性腹膜炎病毒的试剂盒中的用途。[0052]以下，结合实施例进一步详细说明本公开。[0053]以下实施例中所使用的SEQ ID NO.1-4所示的引物由哈尔滨博仕生物有限公司合成，引物序列及名称如表1所示：[00]表1

[0055]

实施例1[0057](1)样品获得[0058]取6例根据临床症状、血液检查和腹水分析确诊的患有猫传染性腹膜炎的动物的腹腔液作为待测样品。[0059](2)cDNA合成[0060]总RNA提取：用病毒检测用RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)对0.14mL待测样品进行总RNA提取；[0061]逆转录：以FIP-OR(SIQ ID NO.2)为逆转录引物，M-MuLV为逆转录酶(购自上海近岸科技有限公司)对总RNA进行逆转录，合成获得cDNA模板。[0062](3)第一PCR扩增[0063]以合成的cDNA为模板，以SEQ ID NO.1-2所示的核苷酸序列为引物进行第一PCR扩增，反应体系及反应程序如下：[00]反应体系：合成的cDNA模板3μL，2×premix(Takara宝生物工程(大连)有限公司)12.5μL，FIP-OF(10pmol/μL)1μL，FIP-OR(10pmol/μL)1μL，加ddH2O至25μL体系。[0065]反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；72℃继续延伸5min，反应结束获得第一扩增产物；[0066]取3μL的第一扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，以ddH2O为模板的样品为空白对照，检测结果如图1所示。[0067](4)第二PCR扩增[0068]以第一扩增产物为模板，以SEQ ID NO.3-4所示的核苷酸序列为引物进行第二PCR扩增，反应体系及反应程序如下：[0069]反应体系：第一扩增产物1μL，2×premix(Takara宝生物工程(大连)有限公司)12.5μL，FIP-nF(10pmol/μL)1μL，FIP-nR(10pmol/μL)1μL，加ddH2O至25μL体系。[0070]反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；

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72℃继续延伸5min，反应结束获得第二扩增产物。[0071]取3μL第二扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，以ddH2O为模板的样品为空白对照，检测结果如图2所示。[0072]结果显示，仅进行第一PCR扩增没有得到预期的685bp的目的条带。而在第一PCR扩增的基础上进行第二PCR扩增，6例样品均扩增得到了380bp的特异性条带，空白对照没有条带。表示所检测的样本中均存在猫传染性腹膜炎病毒。该检测结果与床症状、血液检查和腹水分析的结果一致，说明本公开所提供的引物和方法能够准确的检测样本中的猫传染性腹膜炎病毒。[0073]实施例2[0074](1)样品[0075]取猫传染性腹膜炎病毒标准毒株FIPV-1146(ATCC：VR-2126)总RNA，进行10倍浓度的梯度稀释，使各梯度中FIPV-1146的浓度为1.363×102ng/μL至1.363×10-10ng/μL共13个稀释度样品。[0076](2)cDNA合成[0077]逆转录：以FIP-OR为逆转录引物，M-MuLV为逆转录酶(购自上海近岸科技有限公司)对样品进行逆转录，合成获得cDNA模板。[0078](3)第一PCR扩增[0079]以合成的cDNA为模板，以SEQ ID NO.1-2所示的核苷酸序列为引物进行第一PCR扩增，反应体系及反应程序如下：[0080]反应体系：合成的cDNA模板3μL，2×premix(Takara宝生物工程(大连)有限公司)12.5μL，FIP-OF(10pmol/μL)1μL，FIP-OR(10pmol/μL)1μL，加ddH2O至25μL体系。[0081]反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；72℃继续延伸5min，反应结束获得第一扩增产物；[0082]取3μL的第一扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，以ddH2O为模板的样品为空白对照，检测结果如图3所示。[0083](4)第二PCR扩增[0084]以第一扩增产物为模板，以SEQ ID NO.3-4所示的核苷酸序列为引物进行第二PCR扩增，反应体系及反应程序如下：[0085]反应体系：第一扩增产物1μL，2×premix(Takara宝生物工程(大连)有限公司)12.5μL，FIP-nF(10pmol/μL)1μL，FIP-nR(10pmol/μL)1μL，加ddH2O至25μL体系。[0086]反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃继续延伸5min，反应结束获得第二扩增产物。[0087]取3μL第二扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，以ddH2O为模板的样品为空白对照，检测结果如图4所示。[0088]由图4的结果可以得知，当将RNA的浓度稀释至1.363×10-3ng/μL时，利用本公开所提供的方法仍可观察到目的条带。相比于图3仅进行第一PCR扩增的检测结果(当RNA浓度稀释至1.363×10-1ng/μL时，可观察到目的条带)敏感性明显提高。说明利用本公开所提供的方法能够更准确敏感的实现样品中猫传染性腹膜炎病毒的检测。[00]实施例3

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(1)样品

[0091]猫传染性腹膜炎病毒标准毒株FIPV-1146(ATCC：VR-2126)，犬冠状病毒CCoV MDJ-19(NCBI：KT1926)、猪流行性腹泻病毒PEDV SD/QD/2015(NCBI：KU1638)。[0092](2)cDNA合成[0093]逆转录：以FIP-OR为逆转录引物，M-MuLV为逆转录酶(购自上海近岸科技有限公司)对各样品进行逆转录，合成获得cDNA模板。[0094](3)第一PCR扩增[0095]以合成的cDNA为模板，以SEQ ID NO.1-2所示的核苷酸序列为引物进行第一PCR扩增，反应体系及反应程序如下：[0096]反应体系：合成的cDNA模板3μL(2.2×103ng/μL)，2×premix(Takara宝生物工程(大连)有限公司)12.5μL，FIP-OF(10pmol/μL)1μL，FIP-OR(10pmol/μL)1μL，加ddH2O至25μL体系。[0097]反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；72℃继续延伸5min，反应结束获得第一扩增产物；[0098](4)第二PCR扩增[0099]以第一扩增产物为模板，以SEQ ID NO.3-4所示的核苷酸序列为引物进行第二PCR扩增，反应体系及反应程序如下：[0100]反应体系：第一扩增产物1μL，2×premix(Takara宝生物工程(大连)有限公司)12.5μL，FIP-nF(10pmol/μL)1μL，FIP-nR(10pmol/μL)1μL，加ddH2O至25μL体系。[0101]反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃继续延伸5min，反应结束获得第二扩增产物。[0102]取3μL第二扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，以ddH2O为模板的样品为空白对照，检测结果如图5所示。[0103]利用本公开的方法检测CCoV时，没有获得目的条带，且有杂带；检测PEDV时，未扩增出目的条带。说明本公开所提供的方法特异性高，不会对其他近似毒株进行非特异性扩增。[0104]以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。[0105]另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。[0106]此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

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序　列　表

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SEQUENCE LISTING<110> 黑龙江八一农垦大学<120> 猫传染性腹膜炎病毒检测用引物组和试剂盒及其检测方法<130> 45HLAU<160> 4<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 22<212> DNA<213> Artificial<220><223> This sequence is synthesized in lab.<400> 1tgtcattcta caaccccatt ac 22<210> 2<211> 22<212> DNA<213> Artificial<220><223> This sequence is synthesized in lab.<400> 2acgagatcac tatcaccaaa gt 22<210> 3<211> 22<212> DNA<213> Artificial<220><223> This sequence is synthesized in lab.<400> 3tcgttatcgt attgtaaaag gc 22<210> 4<211> 22<212> DNA<213> Artificial<220><223> This sequence is synthesized in lab.<400> 4ctaatttttc aagcacggct ac 22

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说　明　书　附　图

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图1

图2

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图3

图4

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图5

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