安徽部分地区冷鲜鸡产气荚膜梭菌的污染分析

安徽部分地区冷鲜鸡产气

荚膜梭菌的污染分析

方向红，戴丽红，颜友荣

（江苏农牧科技职业学院，江苏

泰州

225300）

摘要：产气荚膜梭菌是动物肠道中的条件致病菌，是引起畜禽及人类多种重要疾病的主要病原，是一种人畜

共患性疾病，在禽类会引起鸡最重要的肠炎性疾病，给全世界带来巨大损失。本试验从安徽各地区的市场和超市分批进行采购冷鲜鸡，随后，对其进行产气荚膜梭菌的分离培养，进行生化试验、分子分型试验并研究青霉素等药物的抑菌效果，为产气荚膜梭菌的诊断和预防提供理论和实践基础，对防控人的产气荚膜梭菌性疾病和鸡的坏死性肠炎提供参考。

关键词：冷鲜鸡；产气荚膜梭菌；污染；耐药性中图分类号：S858.23

文献标识码：A

文章编号：1672-9692(2019)09-0050-04

ContaminationanalysisofclostridiumperfringensinchilledchickensinsomeareasofAnhuiprovince

FangXianghong,DaiLihong,YanYourong

（JiangsuAgri-animalHusbandryCollege,Jiangsu

Taizhou

225300）

Abstract:Clostridiumpermisaconditionedpathogenintheintestinaltractofanimals.Itisthemainpathogenthatcausesavarietyofimportantdiseasesoflivestockandhumanbeings.Itisazoonoticdisease.Inandsupermarketsin

thisexperiment,coldchickenswerepurchasedinbatchesfrommarkets

differentregionsofanhuiprovince.Then,theywereisolatedandcultured

forclostridiumperfringens,andbiochemicalandmoleculartypingtestswerecarriedoutresearch,andstudythebacteriostaticeffectofthedrugssuchaspenicillin,forthediagnosisandpre‐ventionofgasclostridiumcapsuletoprovidetheoreticalandpracticalbasis,forthepreventionandcontrolofgascapsuleclostridiumsexualdiseasesandchickennecrotizingenteritis.

Keywords:Chickenofcoldfresh;Clostridiumperfringens;Contamination;Drugresistance

产气荚膜梭菌是一种广泛分布于外界环境和动物肠道中革兰氏阳性厌氧梭状芽孢菌[1-2],属于条件致病菌，对人和动物都会产生致病性[3]。冷鲜鸡的产气荚膜梭菌主要是由于免疫失败而导致抵抗力下降继发感染，饲养管理方面不合理，环境卫生不达标，也能导致病毒侵袭抵抗力较差的鸡群，有的鸡群会发病，严重的造成死亡。预防该病的发生要从

日常管理方面抓起：控制好舍内的温度湿度，确保通风情况良好。每天进行清理鸡舍、消毒鸡群不要太密集[4]。日常的饮食方面更要全面营养合理，增强鸡群的自身抵抗力。周围的环境也要注意，定期进行驱虫驱蚊等工作。及时接种疫苗，增强免疫。

产气荚膜梭菌对雏鸡的伤害很大，能直接导致鸡猝死，有的表现为坏死性肠炎、肠毒血症等，对

收稿日期：2019-06-22作者简介：方向红，安徽潜山人，硕士研究生，副教授，主要从事畜禽疾病的诊断与治疗研究。基金项目：2018年江苏省大学生创新创业训练计划项目，名称：苏皖地区冷鲜鸡产气荚膜梭菌分离鉴定及耐药性研究，编号：201812806008Y。

2019年第9期modernjournalofanimalhusbandryandveterinarymedicine51

养殖业造成了严重影响。对人体的伤害也很大，会导致食物中毒严重者会发生坏死性肠炎，甚者会致气性坏疽[5]。

1

材料与方法

1.1

病料

本试验中的冷鲜鸡购自于安徽各地区的

市场和超市分不同批次分别采集样品58份，进行无菌操作，按照合理的方式进行保存，并尽快送往实验室进行试验。1.2试剂与菌株

TSC培养基、FT培养基、含铁牛

乳培养基等，均购自上海生物生工有限公司。

1.3冷鲜鸡产气荚膜梭菌的分离鉴定1.3.1

冷鲜鸡中产气荚膜梭菌的筛选分离

无菌方法

处理各个样品，将30g冷鲜鸡放入灭菌的器皿内，并混合合适剂量的FT（液体硫乙醇酸盐培养基），随后封好并晃动器皿使鸡肉和培养基充分混合，将其置入恒温培养箱中的厌氧罐内，进行45℃培养20h；培养结束后，接种TSC培养基的培养液在45℃培养24h；待其完全反应后，摘选其中一个黑色菌落于平板上，继续培养，然后摘选其中具有双层溶血环的黑色菌落接种在乙醇酸盐中，常温下进行隔夜培养。1.3.2

分离菌株的镜下观察

在培养基中摘选其中

单个黑菌落进行涂片随后进行革兰氏染色，最后显微镜观察其形状。1.3.3

生化鉴定

主要的生化试验有运动力检查、

枸橼酸盐利用试验、吲哚试验、M.R.试验、V-P试验、硫化氢试验、尿素酶试验、各种糖发酵试验、明胶液化试验和牛乳发酵试验等。1.3.4

产气荚膜梭菌菌株的保存

经过上述试验将该

菌液涂抹在FT平板上，常温厌氧培养15h，接着用实验室处理过的甘油和培养基按一定比例配置为冻存液，最后将其混匀分装进行低温冻存。1.4运用多重PCR方法进行分型鉴定1.4.1

DNA的提取

从经过10～20h培养的FT培养

基中吸取1mL放入2mL离心管内，高速离心机常温2min，弃掉上清液，加入300μLpbs缓冲液，反复离心2次，随后滴加100μL的无核酸酶水，用振荡器震荡将其混合均匀，用100℃沸水煮沸10min，随后置入4℃的实验室离心机中离心20min左右，提取上清液，此结果就是本试验的DNA模板。

1.4.2多重PCR鉴定查阅资料发现产气荚膜梭菌

分为四种分别为α、β、ε、ι，依照其特点设计引物，片段设计大小为α：401bp，β：238bp，ε：3bp，ι：315bp。根据说明进行操作。1.4.3

PCR产物的检测

程序结束后取8μL的PCR

反应产物在1.5%的琼脂糖凝胶中90V电泳45min，电泳结束后放在凝胶成像分析系统中300nm紫外光下照射拍照，将扩增出的目的片段纯化后送到上海生物工程有限公司进行DNA测序。1.5冷鲜鸡产气荚膜梭菌体外抗药性试验1.5.1

产气荚膜梭菌的计数

对之前保存的产气荚

膜梭菌菌株接种划线于TSC培养基中42℃厌氧培养36～48h，挑选单个黑色菌落接种到10mL液体硫乙醇酸盐培养基中，37℃厌氧培养12～15h。用0.5麦氏比浊法调整菌液浓度，按照麦氏比浊管的标准配置0.5麦氏比浊溶液，用1mL移液器吸取300μL培养过的菌液加入另一只与麦氏比浊管相同的试管中，向此试管中加入灭菌过的生理盐水调整其浑浊度与0.5麦氏比浊管一致，最终使菌液浓度调整至106cfu/mL。1.5.2

接种FT固体平板

将调整好浓度后的菌液，

用灭菌过的镊子夹取无菌棉蘸取稀释过的菌液，在试管内挤去多余菌液，旋转挤去，在平板上均匀涂布接种3次，每次旋转平皿60℃，最后沿着平板内缘涂抹1周。注意菌液需要在15min内接种完。1.5.3

贴药敏片

药敏试验的药物有：青霉素G、氨

苄西林、诺氟沙星、头孢氨苄、恩诺沙星、氟苯尼考、多西环素、土霉素、克林霉素、红霉素、林可霉素。菌液涂布FT固体平板后静置5min，用镊子轻轻压紧药敏片，使药敏纸片紧贴平板上，注意各药敏纸片中心相距＞24cm，纸片距离平皿内缘＞15cm，一个平皿贴4个药敏片。药敏片贴完后，放入厌氧罐中37℃培养24h。1.5.4

测量抑菌圈直径

用游标卡尺测量抑菌圈的

直径，手持平皿观察平板，以肉眼见不到细菌明显生长的区域为抑菌环边缘，抑菌圈直径包含纸片直径，以mm为单位。结果评判，抑菌圈直径＜10mm为耐药，10～15mm为中敏，＞15mm为敏感。

2

结果与分析

2.1

细菌的分离鉴定结果

52现代畜牧兽医2019年第9期

2.1.1初步筛选将经过处理的样品在FT培养基中厌氧培养24h，培养瓶上方产生了大量气泡；在TSC平板长出了大量单个黑色的菌落（见图1）；在血平板上出现半透明的圆形光滑的菌落（见图2）。以上特征表明该菌株疑似产气荚膜梭菌，共58个鸡肉样品中有20个出现上述特点，检出率为34.48%。

图1

TSC平板

Fig.1

CharactersofCPcolonyonTSC

图2

血平板

Fig.2

CharactersofCPcolonyonbloodplate

2.1.2显微镜下观察结果从TSC培养基中，挑选黑

色的单菌落，经过对其进行染色镜检，观察到如图3的形态菌株。

图3

显微镜下产气荚膜梭菌形态特征（革兰氏染色，1800*油镜）

Fig.3

CharacteofClostridiumperfringensthroughmicroscope

2.1.3生化试验鉴定结果试验结果表明：样品菌

株能发酵糖类，产酸产气，不发酵甘露醇、山梨醇，不产生吲哚。2.1.4

牛乳发酵试验结果

此试验所分离出的菌株

牛乳发酵试验都具有很明显的发酵现象，所得到的结果正与产气荚膜梭菌的特征相同，所以可以得出结论，此为产气荚膜梭菌。

2.1.5多重PCR试验对菌株类型的鉴定结果见表1。

表1

多重PCR试验对菌株类型的鉴定结果

Table1

IdentificationofStrainTypesby

MultiplexPolymeraseChainReaction

菌型结果A型α(401bp)条带

B型α(401bp)条带、β(236bp)条带、ε(3bp)条带

C型α(401bp)条带、β(236bp)条带D型α(401bp)条带、ε(3bp)条带E型

α(401bp)条带、ι(315bp)条带

电泳试验结束后分离出的菌株都只扩增了一条与α（401bp）条带基本相似的条带，试验对照无此结果，依据目的条带的测序规则，结果均与αbp）条带基本序列相同，可以得出70株产气荚

膜梭菌全都是A型。

M为2000bpmark，A、B、C、D为标准菌株，

1、2、3、4为样本，5为阴性对照图4

多重PCR对产气荚膜梭菌分型

Fig.4

Multi-PCRdetectionofClostridiumperferingens

2.1.6药敏试验结果药敏试验结果显示，大多数

菌株对林可霉素的耐药性最高达50%以上，而治疗产气荚膜梭菌最有效的药物就是氟苯尼考和氨苄西

（4022019年第9期modernjournalofanimalhusbandryandveterinarymedicine53

林，具体见表2。

表258株产气荚膜梭菌药敏试验结果Table2

Thedrugsensitivityresultsof58

isolatesofClostridiumperfringens药物耐药率林可霉素76.42%红霉素74.91%克林霉素74.39%土霉素71.86%多西环素66.32%诺氟沙星56.3%氟苯尼考0.3%氨苄西林5.33%青霉素8.23%头孢氨苄32.25%恩诺沙星

21.44%

3

讨论与结论

3.1

产气荚膜梭菌是一种传染病也是人畜共患病，

它对人和动物的健康都有着严重的损害[6]。而健康的鸡和健康的鸡肉中是肯定不携带产气荚膜梭菌细菌得，因为一系列不正当的人为操作，在对鸡的生产宰杀、储藏、配送的路上很容易造成外在感染产气荚膜梭菌[7]。因此，要保证在所有环节中要规范操作，杜绝人为的原因造成的污染。3.2

通过查阅资料发现，在一些发达国家和发展中国家产气荚膜梭菌所造成的食物中毒名列第二，有一些人的腹泻与产气荚膜梭菌都有着密不可分的关系，产气荚膜梭菌也会导致一些疾病的频发。主要使人和鸡患病的产气荚膜梭菌类型为A型，本次试

验从冰鲜鸡肉当中分解出的主要类型均为产气荚膜梭菌A型，与主要引起鸡致病的为产气荚膜梭菌A型的结论相吻合。而一些部分的A型产气荚膜梭菌可能会引发人的食物中毒，是因为A型产气荚膜梭菌在肠道中能产生肠毒素。3.3

本项目调查发现，安徽部分地区冷鲜鸡产气荚膜梭菌的检出率为34.5%，而通过研究发现：澳大利亚为66%，日本的为95%，美国的为38%，这组数据表明目前全世界范围内的冷鲜鸡中都存在不同程度的产气荚膜梭菌感染，这对公众的健康也造成了各种各样的威胁。所以现在全世界都在想办法努力解决产气荚膜梭菌问题。

参考文献

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[7]刘秀峰，陈东宛，吕金昌，等.一起由快餐盒饭引发的

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