显微技术试验报告

一、实验目的

1.掌握石蜡制片的基本方法；

2.观察及判断女贞叶片细胞组织的形态变化的主要方法，掌握其各时期结构特点、选材方法； 3.了解光学显微镜切片制作技术的基本方法步骤。

二、实验原理

自然状态下活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构。所以研究中多数动、植物材料都必须经过固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤处理，将组织分离成单个细胞或薄片，才能清晰辨认其形态结构。

切片法，是材料经过一系列特殊的处理，利用刃具将组织切成极薄的片层，经过固定、脱水、包埋、切片、染色等较繁复步骤，最终制成切片的方法。根据各种不同材料的性质要求进行合理选择处理方法。非切片法的操作比较简单，能保持细胞的完整，但是细胞之间的正常位置移动无法反映细胞之间的正常联系。切片法虽工序繁琐最能保持细胞间的正常的相互关系，能长期完好地保留细胞的原貌，是制作永久性显微切片标本主要方法。

石蜡渗入组织块的内部起支持作用并将整个组织块包住，然后再用精密的切片机制作切片，获得良好的制片效果。石蜡有其独特的优点：石蜡能切出极薄的蜡片（2～10μm）；切片时能连成蜡带，便于制作连续切片；操作较容易，组织块可以包埋在石蜡中长期保存。但处理中常引起组织部分收缩，切片时受温度、湿度影响较大。

三、实验仪器、材料和试剂

1.仪器：荧光显微镜、普通显微镜、石蜡包埋工具、恒温箱、包埋箱(熔蜡箱)、旋转切片机、卧式染色缸、载玻片（76×26mm，T=1-1.2 mm）、方形盖玻片、电热温台、毛笔、石蜡容器、烧杯、滴管、玻璃板、吸水纸、石蜡 2.材料：校园内的幼嫩的女贞叶片

3.试剂：无水乙醇、甲醛、等级乙醇、蒸馏水、二甲苯、氯仿、冰醋酸、石蜡、甘油、苯、加拿大树胶、固定液、染色剂、1%番红水溶液、0.1%固绿酒精溶液

四、方法步骤

1.选材取材

采取标本前，要根据制片的要求，选择并配制固定液。研究女贞叶片正常结构选择健全而具有代表性的部位取材新鲜便于固定剂迅速渗入内部取材时要详细记录日期、采集地点、标本名称、时期、取材部位、断面和固定液等。 取材后应立即投入固定液，以防女贞叶片组织自溶和腐败。用锐利刀片将女贞叶片快速准确切割成所需的大小，切勿拉锯式的来回切取，轻轻镊取放入固定液中，切取组织大小一般为5mm×5mm，不易超过1cm2。 2.固定

在一定时间内，组织和细胞离开机体后仍然延续着生命活动。为了防止标本发生病理变化，保持原有的形状和结构，必须尽早地用某些化学药品迅速地杀死组织和细胞，并将结构成分转化为不溶性物质，防止某些结构的溶化和消失。

固定剂的作用于细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下来，从而保存细胞的

各种组成成分、形态和结构。固定剂会使柔软组织适当硬化而不易变形，便于随后的处理，改变细胞内部的折光率并助染某些难于染色部位，使细胞结构变得清晰并易于保存。

将切取好的新鲜女贞叶片，与临用前配制的卡诺氏液以1：20的比例加入固定时间为12-24小时。本植物材料表面有毛茸或其它不易穿透的物质，则可用含有酒精的固定液固定。材料投入固定液后含有气泡，将气泡抽出，使材料下沉。卡诺氏液中纯酒精固定细胞质，冰醋酸固定染色质，二者穿透力强并能防止组织由酒精引起的高度收缩与硬化。 3.浸洗、染色

固定完毕后，将材料从固定液中取出冲洗用70%酒精洗掉固定液，经50%、30%酒精复水至蒸馏水中，各级1小时，再入苯胺番红溶液中整染48小时。必须冲洗至其中含有的固定液全部除去，否则妨碍染色和保存。本实验的卡诺氏液是用95%的酒精溶性固定剂要用相同浓度的酒精冲洗。 4.脱水

植物组织中含有大量的水分，水石蜡是不相溶致使在包埋时石蜡无法渗入组织内部，因此须使用脱水剂将水分除尽。脱水剂必须能与水以任何比例相混合。非石蜡溶剂乙醇、丙酮脱水后必须再经过透明，才能透蜡包埋。乙醇因价格便宜，易于得到而被广泛作为脱水剂。

为了避免剧烈的扩散引起的组织收缩，脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行。 将女贞叶片组织放入盖瓶中从30%乙醇开始，经过30%、50%、70%、85%、95%、100%无水乙醇至完全脱水，各级乙醇中放置时间为30min。对于一些柔软的组织应从15%开始。如果中间须停顿，应使材料停留在70%乙醇中，因为低浓度乙醇易使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆化组织作用，放置时间不能过长。脱水必须在有盖瓶中进行防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。 5.透明

透明剂能与脱水剂相溶又能与包埋剂相溶的特性使组织中的酒精被透明剂替代，石蜡能很顺利的进入组织中并增强组织的折光系数。

二甲苯作用较快，透明力强，但组织块在其中停留过久，容易收缩变脆变硬。将女贞叶片组织块先经过纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯透明两次，间隔30min。材料经过透明，会显示出前一步脱水的效果，若脱水彻底，组织则显现透明状态，如组织中有白色云雾状，说明脱水不净。使用二甲苯透明时，应避免其挥发和吸收空气中的水分，并保持其无水状态。 6.浸蜡

将石蜡浸入整个组织的过程称为浸蜡。本实验选用石蜡熔点约在54-56℃软石蜡。品质优良石蜡其凝结且无气泡和裂痕，蜡块裂面不呈颗粒状，切成薄片不碎成细粒。含有杂质的新蜡或用过的废蜡可清洁后再用，方法是将石蜡放入锅内，加热到开始冒白烟，然后用小火继续加热30min使其去除水分和挥发性杂质，并在温箱中过滤以去除灰尘等颗粒。

将女贞叶片组织留在透明剂二甲苯中，倒上一层已熔化的石蜡，其比例约为3﹕2。 倒入的石蜡立即凝成固体，然后将材料放在35-37℃之间的熔蜡炉内，经一、二天石蜡不再继续熔化时为止。将材料移入60℃的恒温箱中，停留2-5小时，待石蜡融化后，换纯石蜡应处理2～3次，每次停留1-2小时。

浸蜡过程尽量保持在较低温度中，以保持石蜡未凝固，力求在最短时间内完成石蜡的浸透过程。因为温度过高或时间过长都会引起组织变硬、变脆、收缩等，影响制片效果。 7.包埋

被石蜡浸透的女贞叶片组织连同熔化的石蜡，一起倒入一定形状的容器(如纸盒)内，并立即投入冷水中，使它立刻凝固成蜡块的过程。

包埋前，根据材料大小用坚韧的纸折成纸盒并写好标签；将展片台及酒精灯取出，放在

熔蜡炉或恒温箱旁；在脸盆中放入冷水备用并准备好镊子，拨针。

从恒温箱中取出盛满熔化石蜡的小瓶，并随手将恒温箱的门关闭，立即将小瓶中的石蜡和材料一起倒入包埋用的纸盒中，如果纸盒中蜡的量少，可再加入适量的蜡。将镊子在酒精灯上烧热，夹取女贞叶片材料使其切面向下，用烧热的针拨正材料块在蜡中的位置，使材料之间要保持一定的距离和正确的方向，将拨针烧热，沿着纸盒的边缘以及材料的周围轻轻移动，将蜡中的气泡赶走和使蜡凝固时较均匀。材料块放置恰当后，用左右手握住纸盒两耳，半浸于冷水中，用口吹气的方法，使蜡表面凝结，然后迅速把纸盒全部沉入冷水中，冷却约30min后取出。石蜡凝结后，除去纸盒即可。 8.切片

固着：用加热的刀片将包埋块粘贴固定在台木，并使组织块朝外，便于迅速切出所需片子。整修：将蜡块的前后、左右四个面，两两修成平行的面，保证切出蜡带是直线。保留组织周围附着宽2-3mm的石蜡。不要太靠近组织，更不能将组织露在外面，修成梯形便于在蜡带上识别切片。

旋转式切片机，切片时切片刀固定不动，转动转轮，标本台上下运动并按调好的切片厚度向前推进一定的距离，组织块上下运动一次，便在刀片上得到一张合乎厚度要求的切片。

装刀前，必须检查刀口是否锋利。将切片刀装在夹刀部，调整刀片的角度5-8℃。将粘有蜡块的台木装在切片机的装物部位上，调整蜡块切取面和刀口必须平行，并且使刀口恰好邻近蜡面，切忌蜡块超过刀口。调节为10微米厚度进行切片，右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接住切好的片子，并托住切下的蜡带，待形成一定长度的蜡带后，右手停止转动，持毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片时转动的方向，速度适宜、用力均匀，防止切片机震动引起切片厚薄不均匀。切片可以保存一星期左右，但不宜久置。切片完毕，及时用二甲苯将石蜡油擦净，用氯仿将切片机擦净。 9.贴片

切好的切片必须贴附于载玻片上才能作进一步处理。切片常有细小的横纹，必须经展平后才能贴附，否则影响染色和观察。将涂有粘片剂的载玻片上涂上水，把已分割好的切片光面应朝下展平贴上，再置载玻片于35℃恒定的烫板上让切片摊干，并倾斜或用吸水纸吸去水分，然后将载玻片放烫板上晾干。必须保证载玻片洁净，不能有油污（检验法：已涂有粘片剂的载玻片上滴加数滴蒸馏水，若发现水不均匀分散而聚成滴状，即表示载玻片不清洁，有残留油脂等物在上面）。 10.烤片

烤干便是用恒温箱加热除去水分，使材料在去蜡后依然能够粘在玻片上，烤片时的温度在40-45℃较为适当。 11.染色

组织切片是无色透明的，必须进行染色后才能观察到各种微细结构。一般染色剂是水溶液，因此切片必须经过脱蜡而再度复水才能染色。这正是脱水、透明的逆过程。首先切片放在恒温箱中经二甲苯2次脱蜡，每级半小时，彻底溶去切片上的蜡。脱蜡后，复水至 95%酒精，每级2分钟，把材料放在卧式染色缸用苯胺固绿溶液(0.5%的95%酒精溶液)中复染3-5分钟。

12.切片脱水、透明

染了色的切片必须经过各级不同浓度的乙醇脱水后，才能透明。70％酒精、85％酒精、95%酒精中分色2分钟，100%酒精2次脱水，每级2分钟，放入1∶1无水乙醇二甲苯溶液中，取出并接着浸入到二甲苯二次透明，每级10分钟。标本经二甲苯透明后，折射率改变，透明度提高，使得染上色的部位更清晰地显示出来。 13.封片

封藏的目的是使制成的切片能够永久保存，封藏剂必须能与透明剂互溶，对染色无影响，折射率近似玻璃和具有粘性的物质。

在桌上放一张白纸，将载玻片由二甲苯中取出后，平置纸上，在标本上的二甲苯尚未全挥发之前加一滴加拿大树胶，用右手执镊子夹住盖玻片右侧，将左侧放在树胶的左边，右手将镊子逐渐下降，待盖玻片接触树胶后再轻放，避免产生气泡，也不得拖动盖玻片，以免将标本破坏。万一树胶量太少，可在盖玻片有空隙的地方，再滴注少量树胶使其慢慢浸满盖玻片空间，如树胶过多，溢出盖玻片外，不必马上拭除，待树胶干燥后用刀片刮去多余树胶，再用纱布蘸取二甲苯擦拭干净即可。最后贴上标签，注明材料、染色法，进行烤片待封藏剂凝固后便做成了一张石蜡切片。

五、镜检结果

调节光学显微镜聚光镜，缩小视场光阑，调节照明范围，调节孔径光阑，进行观察。结果如下：

六、注意事项和经验总结

1.无水乙醇有硬化组织的作用，所以材料在无水乙醇中不宜浸得过久。

2.如果包埋处理失败，包埋块全部呈乳白色，并凹凸不平时，应该把它再度投入恒温箱内石蜡杯中，待其熔化后重新移入新的石蜡溶液中包埋。

3.所用的石蜡熔点不宜太高，否则材料块会高度收缩变形。

4.切片时一定要检查切刀锋利、无缺损、角度正确、切片薄厚均匀一致、蜡块中的材料位置良好。材料过脆、切口摩擦产生静电会使平整蜡块切片破碎不成蜡带，而吸附于刀上。 5.染色时，应根据观察目的，样品的结构性质来选择适当的染色方法。材料从某一溶液中进入染色液时，两种溶液的浓度必须相同。酸性染料着色速度快于碱性染料，故二重染色时，碱性染料先染，酸性染料后染。