【精选】基于重叠延伸PCR法的定点突变技术 doc资料

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E-mail:daican@live △ 通讯作者:卢光琇, :

mutant location Primers Sequences for primers (listed 5'to 3'-1~-193bp (relative to ATG

F ggggtaccCTCGCTGTCGCACTCAGGCT

Rm CAGTCAACCGCCACAAAATT Fm AATTTTGTGGCGGTTGACTG R cggctagcAACTGGGTAGGGACGAGGAG 基于重叠延伸PCR 法的定点突变技术* 戴灿苗聪秀 卢光琇△

(中南大学生殖与干细胞工程研究所,人类干细胞 工程研究中心湖南长沙410078

摘要:

目的:建立一种高效而经济的定点突变方法。方法:采用重叠延伸PCR 定点突变技术,引物设计时引入目的突变,以前两次PCR 产物为模板,进行第三次PCR ,即可获得突变后的目的DNA 片段。将此片段连入pMD TM 18-T 载体后测序验证突变结果。结果:DNA 测序表明,待突变位点已由ATTGG 突变为ATTTT 。结论:成功实现了目的位点的定点突变,重叠延伸PCR 法是一种高效且经济的定点突变方法。关键词:重叠延伸PCR ;定点突变

中图分类号:

Q75,Q78,R392文献标识码:A 文章编号:1673-6273(202103-411-02Site-directed Mutagenesis Based on Overlap Extension PCR *

DAI Can,MIAO Cong-xiu,LU Guang-xiu △

(Institute of Reproductive and Stem Cell Engineering,Central South University,National Engineering and Research Center of Human

Stem Cell,Changsha,410078,China

ABSTRACT Objective:To establish a fast,saving method for site-directed mutagenesis.Methods:Overlap extension PCR was used.Briefly,target mutation was introduced into primers,and the two previous PCR products were used as template for the third PCR.The final PCR segment with target mutant was then cloned into pMD?18-T vector for sequencing.Results:DNA sequencing showed that the target site ATTGG had been changed into ATTTT.Conclusion:Site-directed mutagenesis was successfully implemented based on the overlap extension PCR which is a fast and saving method.

Key words:Overlap extension PCR;Site-directed mutagenesis Chinese Library Classification:Q75,78,R392Document code:

Article ID:1673-6273(202103-411-02 前言

定点突变(Site-directed mutagenesis,SDM 是指通过聚合 酶链式反应(PCR 等方法在目的DNA 片段的特定位点中引入 碱基改变,如插入、

缺失、点突变等。定点突变能迅速、高效地提高DNA 所表达的目的蛋白的性状及表征,是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具;它还能改造启动子或DNA 作用元件,是基因研究工作中一种非常有用的手段。如何在体外准确而高效地改变目的位点成为研究者最为关心的问题。本文以插入人类CDCA8基因[1,2,3]正常启动子片段的报告

基因质粒pGL3-269为模板,

采用重叠延伸PCR 定点突变技术快速准确地将CDCA8启动子上的一个NFY 结合位点[4,5]突变,并将获得的突变启动子片段克隆到pMD TM 18-T 载体上,为该片段的进一步克隆和功能的研究提供了便利。

1材料与方法

菌种E.coli DH 5α和带有荧光素酶报告基因的基础质粒pGL3-269由本研究小组前期构建,插入片断为人类CDCA8基因ATG 上游-53bp ~-321bp 区段(269bp ,为正常野生型。pGL3-Basic vector 购自Promega 公司,质粒抽提试剂盒、凝胶

纯化试剂盒、

和Nhe Ⅰ酶切位点;Rm 和Fm 为两条完全互补的引物,且引入

了突变位点,它们分别与侧翼引物F 和R 搭配扩增突变位点及其两侧的启动子片段。

表1引物

Table.1Primers used in this study

注:阴影示突变碱基,下划线示酶切位点Kpn Ⅰ(ggtacc和Nhe Ⅰ(gctagc。Notes:The bases for substitutions were shadowed,the restriction sites Kpn

Ⅰ(ggtaccand Nhe Ⅰ(gctagcwere underlined. 411··

重叠延伸PCR法是通过3个PCR反应来完成的(如图 1。首先以基础质粒pGL3-269为模板,用正向侧引物F和突变

引物Rm进行PCR1扩增(采用Pfu酶,产物含突变位点及其 上游片段;此外也以基础质粒pGL3-269为模板,用反向侧引物 R和突变引物Fm进行PCR2扩增(采用Pfu酶,产物含突变 位点及其下游片段。PCR1和PCR2可同时分别进行,产物经琼 脂糖凝胶电泳分离、试剂盒回收纯化后等比例混合。取上述混 合物为模板,用正、反向侧引物F和R进行PCR3扩增(采用 Taq酶,产物即为引入了目的突变的269bp启动子片段。以上 PCR循环条件均为94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃退 火30s,72℃延伸20s,共30个循环;末次循环后,72℃再延伸 2min(Pfu或10min(Taq。PCR反应总体积为20~50μL:1×

物,2μL模板。

将突变启动子片段16℃过夜连接到pMD TM18-T Vector, 连接产物经转化、涂板后,挑取白色菌落,摇菌过夜,经菌液 PCR(侧翼引物F和R验证为阳性克隆后,抽提质粒进行酶切 检验和测序鉴定。酶切体系为10μL:1×Buffer1.0μL,质粒 20ng/μL,内切酶KpnⅠ和NheⅠ各0.1U/μL,37℃,反应2h。 2结果

2%琼脂糖凝胶电泳显示,重叠延伸PCR后获得了正确的 突变启动子片段269m(图2A。将此片段连接到pMD TM18-T vector质粒,转化涂板挑克隆后,应用菌液进行PCR鉴定(图 2B,选取第3泳道的阳性重组质粒进行酶切检验和测序分析, 结果显示载体连接正确,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳出现 两条带:约2700bp载体片段和269bp启动子插入片段(图2D, 与预期结果一致;目的位点突变成功,已由ATTGG突变为 ATTTT(图2C。 3讨论

本研究基于PCR的方法,快速有效的在基因特定位点引 入特定突变。重叠延伸PCR法适用于DNA片段中间区域的碱 基改变,它采用互补引物(含有使重构基因所需的遗传改变的 碱基掺入,如点突变、插入或缺失,使两次PCR产物之间形成 了重叠链从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸拼接起 来。含有目的碱基改变的引物设计是基于PCR方法成功进行 定点突变的关键,突变点最好是位于引物的中间部位或5’端, 尽量避免出现在3’端。突变引物Fm及Rm为中间引物,它们 可以部分重叠(至少10bp完全匹配,也可以如本研究中Fm 和Rm完全重叠。侧翼引物F和R的5’端分别引入KpnⅠ和

NheⅠ酶切位点,为后续突变片段的克隆提供方便。另外,分别 用引物F和Rm及Fm和R进行配对PCR时一定要用pfu酶, 不要用Taq酶,因为Taq酶会在PCR产物末端加A,从而可能 会使产物移码突变。

本研究通过三次PCR即成功的将CDCA8启动子上的一 个NFY结合位点进行了突变,相比传统的体外突变技术及试 剂盒法更加的简便和经济。 参考文献(References

[1]Gassmann R,Carvalho A,Henzing AJ,et al.Borealin:a novel chromosomal passenger required for stability of the bipolar mitotic spindle[J].J Cell Biol,2004,166(2:179-191

[2]Sampath SC,Ohi R,Leismann O,et al.The chromosomal passenger complex is required for chromatin-induced microtubule stabilization and spindle[J].Cell,2004,118(2:187-202

[3]Klein UR,Nigg EA,Gruneberg U.Centromere Targeting of the Chromosomal Passenger Complex Requires a Ternary Subcomplex of Borealin,Survivin,and the N-Terminal Domain of INCENP[J].Mol Biol Cell.2020,17(6:27-58

[4]Mantovani R.The molecular biology of the CCAAT-binding factor

NF-Y[J].Gene,1999,239(1:15-27.

[5]Zemzoumi K,Frontini M,Bellorini M,et al.NF-Y histone fold alpha1 helices help impart CCAAT specificity[J].J Mol Biol,1999,286(2: 327-37.

[6]黄培堂,俞炜源,陈添弥,等(译.PCR技术实验指南[M].北京:科 学出版社,1999:416-444

Huang Pei-tang,Yu Wei-yuan,Chen Tian-mi,(Translate.PCR Lab Manual[M].Beijing:Science Press,1999:416-444. 图1重叠延伸PCR定点突变示意图(黑点示突变位点 Fig.1Site-directed mutagenesis by overlap extension PCR (black dots represent substitution sites

图2突变启动子片段的克隆与鉴定。(A突变PCR结果;(BpMD? 18-T-269m菌液PCR鉴定结果,泳道2~3、7~8为阳性克隆,泳道1、4~6 为阴性克隆;(CpMD TM18-T-269m质粒测序结果,黑框示NFY结合位 点,阴影示突变碱基;(DKpnⅠ、NheⅠ双酶切pMD TM18-T-269m质粒 结果。

Fig.2Clone and identification of the mutant promoter fragment.(A Products obtained by overlap extension PCR;(Bidentification of pMD TM 18-T-269m by PCR,Lanes2~3,7~8:positive clones;Lanes1,4~6:

negative clones;(Cidentification of pMD TM18-T-269m by sequencing, box indicated binding sites of NFY,the bases for substitutions were shadowed;(DKpnⅠ,NheⅠDouble digestion of pMD TM18-T-269m plasmid. 412 ··

1前言

计算粘性自由面绕流问题是船舶水动力学领域最重要的课题之一,一直是一项挑战性的任务。 目前随着 CFD 数值技术的不断提高和计算机硬件的飞速发展,近年来“数值水池”发展很快,但网 格生成技术和自由液面的模拟方法仍是关键技术之一。

结构网格技术成熟、壁面粘性模拟能力强等优点,因此在非结构、笛卡儿直角网格逐渐盛行的 今天,仍然是船舶 CFD 计算的首选。为了更好地利用结构网格的优点,人们迫切希望开发结构网格 的自动化生成方法,于是出现了多块结构化网格生成方法,但该方法仍然没有真正解决结构网格的 自动化生成技术。现在尽管商业软件(如 Fluent/Gambit在非结构网格、多块结构网格及动网格方 面具有强大功能,但由于船舶 CFD 主要解决两相流问题,要求在自由液面附近的网格具有很高的分 辨率,这一特殊性使得商用软件在船舶六自由度运动、具有较大航态变化的高性能船舶(如快艇、 高速复合船型、多体相对运动以及条件情况等方面模拟具有局限性,若再考虑带附体、边界 的影响,CFD 模拟更是困难。重叠网格(chimera grid 、overset grid、overlap grid的出现 使结构网格的自动化成为可能,上面的难题可获得较容易的解决:如远场背景网格采用笛卡儿直角 网格以保证自由液面的网格分辨率,各物体采用贴体网格,这样就可解决船舶 CFD 模拟问题。 在船舶 CFD 中模拟中,自由面处理方法可分为自由面追踪法(free surface tracing和自由面 捕捉法(free surface capturing。自由面追踪法采用移动网格技术,该方法使网格变形以适合自 由面边界的形状,但对自由面大幅变形情况的数值模拟比较困难。自由液面捕捉方法用混合的空间 网格并且通过解决边界面处的运输方程来捕获自由面位置,最常用的界面捕获方法是 MAC 方法、VOF 方法、Level set方法和 VOF/Level set混合方法。本文采用单相 Level Set方法来模拟自由液面形 状。

2重叠网格方法

重叠网格方法将复杂的流动区域分成几何边界比较简单的子区域,各子区域中的计算网格 生成,彼此存在着重叠、嵌套或覆盖关系,流场信息通过插值在重叠区边界进行匹配和耦合。重叠 网格即拥有结构网格逻辑关系简单、流场计算精度高、效率高、壁面粘性模拟能力强等优点,更弥 补了结构网格对外形适应能力差的缺点。重叠网格的应用越来越广泛,国外比较著名的重叠代码:如 NASA 的 PEGASUS、ARL 的 SUGGAR 及 SUGGAR++、OVERTURE 等,并且还在不断地推陈出新。

1

2重叠网格方法的最终目标是建立各重叠网格间的耦合关系,为各区域流场计算提供边界信息的 传递服务。如图 1所示:网格 1落入网格 2物面内的点被标记为洞内点而不参与流场的计算。网格 1中与洞点相邻的点为洞边界点(图 1中的方点,这些点通过插值接受从网格 2传递的流场信息。 相应地,网格 2的外边界点(图 1中的圆点也通过插值接受从网格 1传递的流场信息,任意变量 f 由相应的六面体贡献单元采用 trilinear 方法插值获得(1式。网格 1的洞边界点和网格 2的外 边界插值点之间的区域为重叠区域。图 2为典型单体船静态的船舶重叠网格。

=++++1121415f f (-ff di + (-ff dj + (-ff dk

+ (f-f f f djdk

+ (-ff f +ff f −78f f didjdk (1

其中:di,dj,dk 为[0,1]间的插值权系数。

图 1重叠网格示意图 网格 1的 洞边界点 网格 2的 固壁边界 网格 2的外 边插值点 网格 2 网格 1

3

重叠网格生成的工作并不是简单地等于各子网格的生成,更为重要的内容是确定各子网格之间 的重叠关系,以及确定各子网格之间的数据插值传递关系,因此重叠网格包含两个主要的步骤:挖 洞和插值。挖洞的目的是在流场计算前从网格中屏蔽掉一些不必要或者无实际意义的部分(如物体 壁面内部。具体而言,是在需要屏蔽的区域周围设定挖洞面,然后将落入挖洞面内的网格点标识 出来, 并在 CFD 计算过程中予以舍弃。 挖洞方法可以分为指定挖洞面法、 洞映射方法以及叉树方法, 本文采用洞映射方法。寻点是在网格中寻找插值点的贡献单元。寻找贡献单元最简单、最可靠的方 法是遍历整个网格域,直到找到正确的网格单元。但是,这种方法的效率是最低的,对于数据量稍 大的网格,其搜索速度异常缓慢。利用优秀的数据结构可成量级地提高寻点速度,现在常用的方法 为叉树法和 ADT 方法,本文采用 ADT 方法。

3 单相 Level Set方法 3.1 自由液面捕捉

定义 Level Set函数 ϕ(流场任意一点到自由液面距离的函数,满足: 0i u t ϕϕ∂+⋅∇=∂ (3

式中: 0 00ϕ<⎧⎪=⎨⎪>⎩ 空气 自由液面 液体

通过插值获得 0ϕ=(自由液面。忽略空气和自由面表面张力的影响,则在自由面(0ϕ=处 应满足如下条件:

0 i i j j i i u x n n x x ϕϕ∂∂∂⋅=∂∂∂, =- (4 2z p Fr

= (5 单相 Level Set方法仅仅对船体流动的求解仅在 0ϕ≤的计算域进行,空气相则是通过速度扩 展(velocity extension的方法来流场速度。因为只考虑单相流场,并且只需要在界面边界处稍加

4

处理,这样就成功避免了上述的两相流界面的过渡问题。此外,在气体中,只需要布置少许网格来 满足 jump condition,因此相比 two phase 方法,计算资源的消耗则是大大减小,计算稳定。单相 level-set 目前被广泛应用于空气和水的自由面问题当中。

4 RANS 控制方程与湍流模型 4.1 控制方程

Reynolds 模仿气体分子运动论里的平均概念,对不可压缩流体的 NS 方程进行时间平均,得到 著名的 Reynolds Averaged Navier Stokes(RANS方程。

不可压缩流体无量纲 RANS 方程的张量形式为: 0i i u x ∂=∂ (7 ______ 2_________' '

1( 0Re i i i j i j j i j j j u u u p u u u t x x x x x ∂∂∂∂∂++−−−∂∂∂∂∂∂= (8 5 船舶六自由度运动求解

求解船舶的运动情况是采用求解运动方程来得到。为此,我们首先要了解船舶在三个旋转轴的 转动惯量。如果我们将载体坐标系的原点定在船舶的旋转点位置上,那么三个方向的转动惯量就可 以从(12式得到。

G G 222, G 222, G ( y+z 0 0 0 00 0 0 ( y+z 0

0 0 0 g x x y g y z m r I I m r I +⎡⎤⎢⎥=+⎢⎥⎢⎥⎣⎦G 222, G 0 ( y+z g z m r ⎡⎤⎢⎥⎢⎥⎢⎥

+⎢⎥⎣⎦

(12 式中, , g j r 为 j 轴方向的惯量半径, G rot CG x x x =−为旋转点与重心位置纵向距离。

根据船体受力平衡,其刚体运动方程见(13-(14式。船体运动后(船舶贴体网格部分, 网格不需要重新生成,仅仅重新生成网格间的插值信息即可,船舶六自由度运动求解流程见图 7, 图 8为典型单体船运动的网格示意图。 22 CGi CGi CGi CGi i d x d d F m L I dt dt dt θ⎛⎞==⎜⎟⎝⎠ (13

5

图 3 六自由度运动运动求解流程 图 4 动网格重叠示意图 6 数值造波

规则波以及长峰或短峰不规则波可通过定义初始边界条件来实现,其在任意时刻的波幅可由 (15式来表示,其为一系列不同波幅、波长和波向的简谐波线性叠加而成。

((, , cos cos sin ij i j j

i ij i j

x y t a k x y t ξμμωφ⎡⎤= −−+⎣⎦ ∑∑ (15

式中:ij φ为随机相位, ij a 为波幅, i ω=

i k 为波数, j μ为入射角。入射角包括

色散角 j α和相对船的遭遇角 0α,这样 0j j μαα=+。单元波波幅 ij a 采用(16式求解。

ij a = (16

式中:(i S ω为谱密度,可采用 ITTC 双参数谱、Bretschneider 谱、JONSWAP 谱公式等。 ([]22

cos 22j j j D -// αααπππ =

⊆, , 为方向扩展函数(ITTC推荐公式。

在上述波浪初始条件下,则速度和压力的表达式见式(17:

(((0, 0, 0, (, , , cos cos sin cos (, , , cos cos sin sin (, , , sin cos sin (, , , i i i k z i j j i ij j

i j k z i j j i ij j

i j k z i j j i ij i j

i U x y z t U k x y t V x y z t V k x y t W x y z t W k x y t a p x y z t μμωφμμμωφμμμωφ⎡⎤=+

−−+⎣⎦⎡⎤=+−−+⎣⎦⎡⎤=+−−+⎣⎦= (2, cos cos sin 2i i j ij k z k z i j j i ij i i j a e k x y t e

Fr k μμωφ⎧ ⎫⎡⎤−−+−⎨⎬ ⎣⎦⎩⎭ ∑ (17 式中: 7 静态计算验证 7.1 单体船算例

采用重叠网格和单相 Level Set 方法对 DTMB15和 KCS 约束船模在 7

Fr Re ==×和 7

0.26, 1.4010Fr Re ==×分别进行了数值模拟,图 9和表 1分别为计算自由面形状和阻力与试 验值的比较,可以看出结算结果与试验结果非常吻合。

≈。 计算无量纲时间步长 0.01t Δ=, 总时间 10T =(其 中加速段总时间 12T =,船前进 9倍的船长,计算平台为 PC Core Quad CPU 2.33G+4.0GRAM,计 算耗时 15小时。

KCS 计算网格状态为:背景网格采用笛卡尔网格 1384160××,物体贴体网格采用 O 型网格

1053961××,总数 5275,计算未采用壁面函数, 1.0y +≈。计算无量纲时间步长 0.01t Δ=, 总时间 10T =(其中加速段总时间 12T =,船前进 9倍的船长,计算耗时 10小时。

图 5 DTMB15 and KCS 自由面形状 表 1 阻力比较

4.32 DTMB15 EXP

3.61 KCS EXP

2.83(ITTC57 3.56 Cal[本文] 5.478 4.305 9.783 Cal(文献[8]5.331 4.525 9.856 Wigley 双体船

EXP(文献[8]

7.2 多体船算例

本文还对双体船和三体船约束船模在 6 0.55, 1.72210Fr Re ==×和 6

0.3, Re 4.610Fr ==×进行数值模拟,重叠网格见图 10,计算自由面形状见图 11,双体船的阻力计算结果见表 1。

双体船计算网格状态为:背景网格采用笛卡尔网格 1015651××,物体贴体网格采用 O 型网格 2×71×48×50, 网格总数 4709。 计算未采用壁面函数, 1.0y +

≈。 计算无量纲时间步长 0.01t Δ=, 总时间 10T =(其中加速段总时间 12T =,船前进 9倍的船长,计算耗时 8小时。

双体船计算网格状态为:背景网格采用笛卡尔网格 8046××, 主体和片体的贴体网格采用 O 型网格 3×71×51×39,总网格数 5257。计算未采用壁面函数, 1.0y +

≈。计算无量纲时间步长

0.01t Δ=,总时间 10T =(其加速段总时间 12T =,船前进 9倍的船长,计算耗时 7小时。

图 6 双体船和三体船重叠网格

图 7 双体和三体船自由面形状 7.3 浅水及池壁影响算例

本文还对浅水单体肥大型 (长宽比 /3.817L B =, 宽吃水比 /7.40B T =, 方形系数 0.83Cb = 约束船模(图 12在 6

0.119, 4.7510Fr Re ==×进行了有无池壁效应的浅水影响下的数值模拟,水 深与船长比 /0.03H L =, 池壁宽与船长比 /1.008b L =。 CFD 区域及计算网格见图 13, ,计算自 由面波形对比结果见图

14,可以看出池壁效应在浅水条件下的影响非常大。

图 8 肥大型船模

图 9 计算区域和网格 无池壁影响 池壁影响

图 10 自由面形状对比

说明:由于本船的吃水/船长比过小(见图 15且本船方形系数 Cb 过大, 故在浅水计算中很难采 用动态重叠网格进行航态计算,实际航态计算采用静态修正方法进行的,以节省计算资源。若采用 动态重叠网格计算需要很小的时间步长和较多的网格。

为验证物面重叠方法的有效性, 本文还对带附体的 Suboff 模型在 6 0.316, 4.010 Fr Re

==×进 行了近水面情况下的数值模拟,其计算网格见图 15,计算自由面波形结果见图

16。

图 11 suboff计算网格

图 12 近水面自由面波形

8 动态计算验证

8.1 静水自由船模阻力算例

采用重叠网格和单相 Level Set 方法对 60约束船模和自由模在 6

0.316, 4.310Fr Re ==×进行 了数值模拟。计算网格状态均为:背景网格采用笛卡尔网格 1013662××,物体贴体网格采用 O 型 网格 74×36×59,网格总数 346248。计算未采用壁面函数, 1.0y +

≈。计算无量纲时间步长

0.01t Δ=,总时间 20T =(其中加速段总时间 12T =,船前进 19倍的船长,平均计算耗时 5~

10小时。表 2为计算阻力与试验值的比较,图 17为船体舷侧波形比较和升沉纵倾曲线图。

图 13 S60舷侧波型比较和升沉纵倾曲线图(Fr =0.316,Re =4.3×106 表 2 阻力比较

P C F C T C Cal 2.01 3.51 5.52 S60(fix EXP 3.42(ITTC57 5.42 Cal

2.19 3.56 5.75 S60(free EXP 3.42(ITTC57

8.2 规则波中运动响应算例 本文计算是基于 Journee 在 1992 年所做的四种 WigleyIII 型船模在 Fr = 0.30, Re = 4.88 × 10 6 的迎浪试验。根据模型试验，计算取 7 个不同波长 λ L = 0.50, 0.75,1.0,1.25,1.5,1.75, 2.00 的规则 波，只考虑垂荡和纵摇运动，为了方便和试验值比较，我们定义（18）式的无因次变量，其运动幅 值计算结果与实验结果的对比见图 19，其计算结果与试验值非常接近，这表明船舶在迎浪中运动的 数字模拟还是非常准确的。图 20 为 λ L = 1.25 情况下一个波浪周期中四个不同时刻下的自由面形 状变化。 Z= z ζa θ = θL 2πζ a （18） 计算网格状态为：背景网格采用笛卡尔网格 111× 36 × 65 ，物体贴体网格采用 O 型网格 71× 36 × 50 ，网格总数 3870，重叠网格见图 18 所示。计算未采用壁面函数， y + ≈ 1.0 。对不同 波长状态下，其无量纲周期 T 按(19式计算，计算无量纲时间步长取 T 80 。 1 1 1 = + T λ Fr 2πλ （19） 图 14 规则波中动态重叠网格 Z' 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.25 λ/L EFD CFD 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1.75 2 2.25 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.25 θ' EFD CFD λ/L 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1.75 2 2.25 垂荡运动 纵摇运动 图 15 垂荡和纵摇运动幅值与试验值比较 11

图 16 1 1 3 t= ， ， ,1T 时刻自由面变化（ λ L =1.25 ） 4 2 4 8.3 自航和静水 Z 形操纵算例 o o 本计算基于 10 /10 Z 形操纵试验要求进行，计算中的螺旋桨推力采用简单的体积力来替代，其 推力大小依据螺旋桨敞水试验下的 J , KT , K Q 结果，其中伴流速度采用船舶速度替代。整个数值模 拟中保持转速不变，在上述转速和未操舵的情况下，船舶先通过自航模拟能达到稳定的航速，然后 在该状态下开始进行操纵运动数值模拟。整个过程网格运动策略为：将舵和船体贴体网格作为整体 考虑，一起做纵荡、横荡、垂荡、横摇、纵摇、首摇运动（为了考虑计算稳定性和计算网格简单， 本文计算中未考虑横摇运动，未考虑舵杆影响）。其中自航模拟

中舵不进行控制，Z 形操纵模拟根 据试验规则对舵进行运动控制， 使舵网格绕指定的舵杆转动轴在-10~10 间转动。 背景网格跟随船体 贴体网格一起仅做纵荡、横荡及首摇运动。 计算网格状态为：背景网格采用笛卡尔网格，船体和舵采用 O 型贴体网格，网格总数约 0.7M， 重叠网格见图 21 所示。计算未采用壁面函数， y ≈ 1.0 。 本模拟中螺旋桨固定转速为 n = 16 ，图 22 为自航数值模拟结果，由图可知船舶操舵前达到的 稳定航速为 Fr = 0.2598 。图 23 为 10 /10 Z 操舵数值模拟下船舶 X-Y 平面下的运动轨迹，图 24 为 o o o + 其首向角ψ 和舵角 δ 关系的时间历程图。由图 24 可知，本船的第一次超越角和转向滞后时间分别 为 ψ OV 1 = 2.21 和 TL1 = 0.52T ， 第 二 次 分 别 为 ψ OV 2 = 7.79 和 TL 2 = 1.86T ， 第 三 次 分 别 为 o o ψ OV 3 = 2.81o 和 TL 3 = 0.T 。图 25 为初始状态、左转最大首向角及右转最大首向角情况下的自由 面的形状。通过计算可以看出对于单桨、单舵船，由于螺旋桨旋向的不对称性，船舶左右操舵存在 12

着较为明显的不对称性。为了考虑横摇对操纵性的影响，后续将进行带横摇运动的 Z 形操纵和回转 数值模拟并与试验结果进行对比。 图 17 10o/10oZ 形操纵数值模拟网格 前进方向 图 18 船舶自航模拟结果(n=16 15 10 5 图 19 10 /10 Z 形操舵船舶运动轨迹 o o 无量纲时间T 0 10 -5 -10 15 20 25 30 35 首向角 -15 -20 舵角 图 20 10 /10 Z 形操舵舵角和首向角历程 o o 13

(a 左转最大首向角 17.79 （b）右转最大首向角 12.21 o o 图 21 10 /10 Z 形操舵自由液面变化 o o （c）初始 14

第 39卷 增刊 (II 2021年 11月

东 南 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 JOURNAL O F SOU THEAST UN I V ERS ITY (N atural Science Edition V ol . 39Sup (II N ov . 2021

基于改进双电流探头法的 E M I 噪声源内阻抗测量 赵 波 1, 2 封志明 2 赵 敏 1 水利民 2 姚 敏 1

(1南京航空航天大学自动化学院 , 南京 200016

(2江苏省计量科学研究院 , 南京 210007 摘要 :提出了一种应用于 E M I 噪声源内阻抗测量的改进双电流探头法 . 首先 , 分别利用 2个标准 电阻代替被测噪声源内阻抗接入测试回路 , 或将被测噪声源内阻抗短路 , 依次测量上述 3种测试 回路中注入探头输入电压和检测探头输出电压 , 得到 3个测试回路方程 , 并由此得到测试回路阻 抗的幅值与相位 . 然后 , 将 E M I 噪声源接入测试回路 , 重复上述测试步骤 , 测 E M I 噪声源内阻抗的幅值与相位 , 对 A C 2D C 开 关电源噪声源内阻抗的分析结果表明 , 抗分别呈减小和增大的趋势 .

关键词 :; 中图分类号 ::A 文章编号 :1001-0505(2021 增刊 (II 20217205 E M I noise source i mpedance mea sure ment based on modi fi ed dual 2current 2probe approach

Zhao B o 1, 2 Feng Zh im ing 2 Zhao M in 1 Shu i L im in 2 Yao M in 1(1College of A utom ation Engineering, N anjing U niversity of A eronautics and A stronautics, N anjing 200016, China

(2J iangsu Institute of M etrology, N anjing 210007, China Abstract:A m od ified dual 2current 2p robe app roach app lied to the electrom agnetic interference (E M I noise source i m pedance m easurem ent is p roposed . First, the E M I sou rce i m pedance under test is rep laced by t w o standard resistances or short 2circuited . The input vo ltages of the injection p robe and the output voltages of the test p robe in the three circuits are m easu red, and three circuit equations are ob tained . The am p litudes and phases of the equivalent i m p edances can be calcu lated by solving the th ree equations . Then, the E M I noise source is connected to the test loop. The am p litudes and p hases of the E M I no ise source i m pedances are acqu ired by the above step s . The experi m ental results are close to those by a vector net w ork analyzer . M o reover, the analysis results of the no ise source i m pedance of an A C 2D C s w itch m ode po w er supp ly sho w that w ith the increase of the frequency, the co mm on m ode i m pedance decreases w hile the different m ode i m pedance increases .

Key words:electrom agnetic com patib ility; electrom agnetic in terference; noise source i m pedance;

dual 2current 2p robe app roach

收稿日期 :2021211220. 作者简介 :赵波 (1979— , 男 , 博士生 ; 赵敏 ( , 男 , 博士 , 教授 , 博士生导师 , zhaom in @nuaa . edu . cn . 项目 : 质检总局科技计划资助项目 (2021Q K 104 .

在电 磁 兼 容 (electrom agnetic com patibility, E M C 标 准 规 定 的 传 导 电 磁 干 扰 (electrom agnetic in terference, E M I 测量设置中 , 被测设备 (equipm en t under test, EU T 的电磁噪声由线性阻抗稳定网络 (line i m p edance stabilization net w o rk, L ISN 测得 , 其阻抗特性被严格规范 [1], 测量结果只含有 9~30M H z 的噪声射频电压参数 , 不含噪声源等效噪声源内阻抗参数 . 事实上 , EU T 噪声源内阻抗特性千变万化 , 设 计出与噪声源内阻抗特性相匹配的滤波器方能有效滤除电路中的传导 E M I 噪声 . 因此 , 对 EU T 中传导 E M I 电磁噪声源内阻抗进行测量是非常重要的 [2-3].

目前 , 测量噪声源内阻抗有多种方法 . 文献 [4-5]提出了一种插入损耗法 , 通过在电路中串联共模

(comm on m ode, CM 扼流圈和并联差模 (differential m ode, DM 电容 , 减小电路中 CM 噪声与 DM 噪声 , 并通过测量噪声的变化以得到噪声等效噪声源内阻抗 . 然而 , 这种方法没有涉及噪声源的测量方法 , 且计 算阻抗相 位 的 步 骤 过 于 复 杂 , 因 而 实 用 性 较 差 . 文 献 [6]提 出 了 一 种 测 量 脉 宽 调 制 (pulse w idth m odulation, P WM 驱动电机系统戴维南等效干扰源和阻抗的方法 , 该方法可较准确地测量 P WM 驱动电 机的噪声源内阻抗 , 缺点是实施困难 , 需要专门的检测工具提取噪声电压源信号 , 且应用范围不广 . 文献

[7-8]采用散射参数对噪声源内阻抗进行测量 , 该方法不仅可以较精确地测量噪声源内阻抗的幅值 , 还 能测量其相位信息 , 但对于测试设备要求较高 . 文献 [9-10]采用双电流探头法对于噪声源内阻抗进行测 试 , 该方法实用性较强 , 应用范围较广 , 但是测量中的线缆损耗较大 , 精度有待提高 .

1 噪声源内阻抗测量的理论分析

本文以开关电源 (sw itched 2m ode p ow er supp ly, SM PS 为例 , 量进行理论分析 . 根据传播路径的不同 , SM PS DM 干扰 . CM 干 扰是指电源的相线与中线所构成回路中的干扰信号 , 路中的干扰信号 .

1. 1 测试原理

该方法采用 2[9]. 其中 , 一个电流探头作为注入探头 , 另一个作为接收探 头 . 通过测试 , SM PS 在 E M C 标准规定范围内各频率点的 CM 阻抗和 DM 阻抗 , 具有较好的

测量精度 . 如图 1所示 , 双电流探头法测试的实验装置包括了 1个注入式电流探头 、 1个接收式电流探头 、 1台信 号发生器和 1台频谱分析仪 . 要测量的未知阻抗以 bb ′ 端的阻抗 Z x 来表示 , 2个电流探头 、 耦合电容以及 未知阻抗组成了一条回路 . 当信号发生器输出的正弦波信号 V w 注入到注入式电流探头时 , 电路中产生电 流 I w , 通过频谱分析仪可以检测到 I w 对接收式电流探头的作用结果 . 通过信号发生器中不同频率点的输 出 , 可以在接收式电流探头端获取不同频率点的电流值 .

图 2(a 给出了 aa ′ 端 注入式电流探头的等效电路图 . 图中 , V s ig 和 Z sig 分别表示信号发生器的输出电压

和噪声源内阻抗 , I p 表示注入式电流探头的输入电流 , L p , L w 和 M 分别表示变压器原边的自感 、 副边的自 感和互感

.

图 1 双电流探头法的原理图 图 2 双电流探头法的等效电路图 1. 2 理论分析

若耦合回路中的电流为 I w , 则 V sig =(Z sig +j wL p I p -j wM I w (1 V M =-j wM I p +j wL w I w (2 由式 (1 和 (2 可得 V w =V M 1-Z M 1I w

(3 式中 , Z M 1=-[j wL w +((wM 2/Z sig +j wL p ],V M 1=-[j wM /(Z s ig +j wL p ]Vsig .

式 (3 表明 , aa ′ 端 的注入式电流探头可以用等效的电压源 V M 1和电压源噪声源内阻抗 Z M 1代替 , 如图 2(b 所示 . Z M 2表示检测式电流探头导致的互感 , 则

V M 1=(Z M 1+Z M 2+Z C +Z x I w (4

88 东南大学学报 (自然科学版 第 39卷

令 Z in =Z M 1+Z M 2+Z C , 则式 (4 可简化为 V M 1=(Z in +Z x I w (5

由式 (5 可知 , 未知阻抗 Z x 可表示为 Z x V M 1

I w -Z in (6

检测式电流探头中通过的电流为 I w V p 2 Z T 2(7

式中 , V p 2表示检测式电流探头测得的电压 ; Z T 2表示校准此探头后的转移阻抗 .

将 V M 1=-[j wM /(Z sig +j wL p ]Vsig 和式 (7 代入式 (6 中可得 Z x =-j wMV sig Z s ig +j wL p Z T 2V p 2

-Z in (8 令 K =-j wM Z T 2/(Z sig +j wL p , 则式 (8 可简化为 Z x 2-in (

9

, K V sig 是一个固定系数 . 如果有一已知阻值 的高精度电阻 R s td in |, Z x , 则固定系数 K V sig 可通过下式得到 :

K V s ig ≈ R std V p 2Z x =R std (10

图 3 注入信号经线缆损耗后的频率 2电 压曲线 短路阻抗 Z in 的测试可按文献 [9]的方法 , 即将 Z x 短路测 得 . 然而 , 测量中由于需要探头耦合 , 其导线通常选择普通导 线 , 测试线缆损耗不容忽视 , 该线损与导线长度和测试信号频 率有关 . 如图 3所示 , 信号源在不同频率下输出幅值相同的信 号时 , 过长的测量导线将导致短路电压下降过快 , 该误差对于

噪声源内阻抗测量影响较大 . 本文提出采用一个微小电阻和短路阻抗进行串联的方法

以提高测量精度 . 此时 , 短路阻抗可表示为

Z ′ in =Z in +Z sm a ll (11 将一个微小电阻接入测试回路 , 可得

Z in K V s ig V p 2Z x =Z s m a ll -Z sm a ll R std V p 2Z x =R std V p 2Z x =Z s m all -Z sm a ll (12 在准确测量 Z in 的基础 , 对噪声源内阻抗进行测量 , 将 Z x 处接上待测设备 , 则噪声源内阻抗为

Z x -Z sm a ll =

K V V p 2Z x =Z SM PS -Z in =R std V p 2Z =R V p 2Z x =Z SM PS -R s td V p 2Z =R V p 2Z x =Z s m all

(13 由式 (13 可得待测设备的噪声源内阻抗与微小电阻阻抗的矢量差模 , 从而得到不同频率时的 Z x . 2 实验结果及分析

2. 1 实验步骤

采用已知阻抗的电阻对该方法的可行性进行实验验证 . 实验中 R std =500Ω, 选取 10Ω的电阻作为用 来减小线损的微小电阻 , 选择泰克公司的 C T 1和 C T 2作为双电流探头 , 将其接入电路进行测量 . 由于电压 信号太小 , 要将所测得的信号通过信号放大器进行电压放大 , 然后将放大后的信号接入频谱仪 , 其电路连

接如图 4(a 所示 [11]. 将测得的阻抗值与采用矢量网络分析仪 (vector net w o rk analyzer, VNA 的散射参数

法 [7]-[8]的测量结果以及采用双电流单电阻方法的测量结果进行比较 . 9

8增刊 (II 赵波 , 等 :基于改进双电流探头法的 E M I 噪声源内阻抗测量

分别选取阻值为阻值 200Ω的电阻 、 容值为 5600pF 的电容以及电感为 1. 5μH 的电感进行实验 , 以 验证在噪声源内阻抗呈阻性 、 容性和感性情况下该方法的正确性 . 实验结果如图 4(b ~(d 所示

.

图 4 改进双探头法的实验装置及结果

由图可以看出 , 采用改进双探头法测得的阻抗值与 VNA 测得的结果相近 . 特别地 , 随着频率的上升 , 由于双电流探头法存在线路损耗 , 使得测量值与实际值间的误差较大 , 利用改进双探头法测量得到的结果 则较为准确 . 该方法可以更好地解决短路线损问题 , 使整个频段内的测量结果更为准确 .

2. 2 实验台的建立

由于所要测量的 SM PS 工作于高电压状态下 , 而电流探头工作于低压范围内 , 因此需要建立相应的实 验装置使该方法可以测量 SM PS 噪声源内阻抗 .

图 5(a 和 (b 分别为 SM PS 中 CM 噪声源内阻抗和 DM 噪声源内阻抗的测量原理图 . 测试 CM 噪声 源内阻抗时 , 在 L ISN 与 SM PS 之间加 1个电感为 16m H 的

C oilcraft CM T 321622型共模扼流圈 ; 测试 DM 噪声源内阻抗时 , 在 L I SN 与 SM PS 之间加 2个电感为 350μH 的 Z ion V SM 300型差模线圈

.

图 5 噪声源内阻抗的测量原理图

在图 5(a 中 , 2个 1μF 的电容分别接在火线与地线 、 中线与地线之间 . 为了使电路的 Z ′ i n 可进行重复

测量并尽量保持恒定 , 这 2个电容必须固定在印刷电路板 (PCB 上 , 同时注入式和接收式电流探头也必须 固定在电路板上 . PCB 与测试设备间的连线必须尽量短 , 以减小导线布局引起的寄生效应 . 这种测试方法 的优点在于 , 一旦电路校准后 , 测得的 Z in 不仅适用于共模噪声源内阻抗测量 , 同样也适用于差模噪声源内 阻抗测量 , 从而大大提高测量速度 .

2. 3 噪声源内阻抗的测量

根据图 5建立实验装置 , 测量某 SM PS 噪声源内阻抗 , 结果如图 6所示 . 可以看出 , 噪声源的 CM 噪声

09 东南大学学报 (自然科学版 第 39卷

源内阻抗随着频率上升而减小 , 呈容性 , 经拟合可知 CM 噪声源内阻抗由 1个 1. 2Ω的电阻和 1个 450pF 的电容串联构成 ; DM 噪声源内阻抗随着频率上升而增大 , 呈感性 , 经拟合可知 DM 噪声源内阻抗由 1个 15Ω的电阻和 1个 1. 8μH 的电感串联构成 . 获知 SM PS 的 CM /DM噪声源内阻抗后 , 即可进行针对性的 滤波器设计

.

图 6 3 结语

测量 E M I , 由于测量的是射频信号 , 测量电路中的测试线缆损耗较大 , 测量结果误差 也较大 . 本文对于采用短路测量方式的双电流探头法测量模型进行了改进 , 通过采用双阻抗法来减小其线 损 . 实验结果表明 , 这种改进的方法可以更加准确地测量噪声源内阻抗 , 进而更好地指导 E M I 滤波器的设计 .

参考文献 (References

[1]International Electrotechnical C omm ission (IEC . C I SPR 1621Specification for radio disturbance and i m m unity m easuring

apparatus and m ethods 2Part 121:radio disturbance and i m m unity m easuring apparatus 2m easuring apparatus [S ].G eneva:IEC Press, 2020.

[2]Paul C R. Introduction to electro m agnetic co mpatibility [M].2nd ed . N e w York:John W iley &Sons Inc, 2020:4142426.

[3]L aszlo Tihanyi . Electrom agnetic com patibility in pow er electronics[M].N ew York:IEEE p ress, 1997:1212135.

[4]Zhang D , C hen D Y, N ave M J, et al . M easurem ent of noise source i m pedance of off 2line converters .

IEEE Trans on

Pow er Electronics[J ],2000, 15(5 :8202825.

[5]Schneider L M. N oise source equivalent circuit m odel for off 2line converters and its use in input filter design [C ]//Proc

IEEE E M C Sym posium. W ashington D C, 1983:1672175.

[6]R an L , C lare J, B radley K . M easurem ent of conducted electrom agnetic em ission in P WM m otor drive system s w ithout the

need for an L I SN [J ].IEEE T rans on E M C, 1999, 41(1 :50255.

[7]Hu B , See K Y, R ichard W C. Evaluation of ferrite core E M I supp ression under realistic w orking conditions [C ]//The 19th International S ym posium on E M C. Zurich, Sw itzerland, 2021:7742777.

[8]Tarateeraseth V , H u B , See K Y, et al . A ccurate extraction of noise source i m pedance of an SM PS under operating

conditions [J ].IEEE T ransactions on Pow er E lectronics, 2021, 25(1 :1112117. [9]See Kye Yak, D eng Junhong, M easurem ent of noise source i m pedance of SM PS using a t w o current p robes app roach [J ].

IEEE transactions on Pow er E lectronics, 2004, 19(3 :8622868.

[10]D eng Junhong, See Kye Yak . C haracterization of R F noise source i m pedance for sw itched m ode pow er supp ly [C ]//The

17th International Zurich Sym posium on E M C. S ingapore, 2020:53720. [11]Zhao B o, Zhao M in, Feng Zhi m ing . S tandard resistor calibration m ethod in m easurem ent of noise source i m pedance using

dual 2p robe app roach [C ]//Proceedings of 5th A sia 2Pacific C onference on Environm ental Electrom agnetics . X i ’ an, C hina, 2021:4082411. 19增刊 (II 赵波 , 等 :基于改进双电流探头法的 E M I 噪声源内阻抗测量