RAFT聚合法合成蛋白质分子印迹聚合物研究进展

开发与应用

RAFT聚合法合成

蛋白质分子印迹聚合物研究进展

杨雪，孙艳>

(天津大学理学院，天津300350)

摘 要：制备具有高选择性和亲和性的分子印迹聚合物（MIPs)是分子印迹技术发展的主要目标以蛋

聚合法作为活性可控自由基聚合的一种方法，单体选择范围广且

白质等生物大分子为模板的分子印迹技术，面临蛋丨'1质传质阻力大和蛋白质分子印迹聚合物形成的印迹位点不 精确的问题。可逆加成-断裂链转移（R反应条件温和:通过1^八1

^

AFT)

法制备得到的\\1«^具有结构可控，形成位点均一等优点，有利于形成高质量的精

确位点，增加选择性和亲和性。

关键词：分子印迹；蛋白质印迹；可逆-加成断裂链转移；后功能化中图分类号：TQ 028; 0658

文献标识码：

A

文章编号：167卜0460 ( 20丨9 ) 01-0077-04

Research Progress in Synthesis of Protein Imprinted

Polymer by RAFT Polymerization

YANGXue, SUNYan

(School of Science, Tianjin University, Tianjin 300350, China)

Abstract: The preparation of molecularly imprinted polymers with high selectivity and affinity is the main objective in developing molecular imprinting technique. Molecular imprinting technique of proteins and other biomacromolecules is challenged by the difficulties in molecular diffusion and formation of high-quality imprints. As a kind of controlled radical polymerization, reversible-addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization possesses properties of wide range of suitable monomers and mild reaction condition. The MIPs prepared by RAFT polymerization with controlled structures and homogeneity is beneficial to fonnation of high-quality accurate imprinting sites, which has advantages of improving selectivity and affinity.

Key words: Molecular imprinting; Protein imprinting; Reversible-addition fragmentation chain transfer (RAFT); Post-functionalization

分子印迹技术是模拟抗原与抗体相互识别作用 合成分子印迹聚合物

polymers, MIPs

（MoWularly

机溶剂，ffl用水做溶剂却大大降低了模板与功能单体 间作用力，不易形成高质量的精确印迹位点。

通过抗原决定簇法|7'81、表面印迹法12'91°]及纳米 尺度化\"\"等方法可有效降低传质阻力，但如何提高

MIPs

imprinted

),形成与模板分子的“形貌”互补

的空穴，通过记忆效应可对预定模板进行再吸附识 别M'21。与昂贵且不易保存的天然抗体相比，MIPs具 有成本低，制备过程简单，稳定性高，便于保存等 特性|31，虽然在有机溶剂中以小分子为模板的分子 印迹技术取得了很大进展，但以蛋白质等生物大 分子为模板制备蛋内质分子印迹聚合物面临诸多 困难|4_61:首先，蛋白质体积大，分子量高（大于10

KD

的选择性和亲和性，制备具有高质量印迹位点

仍是一个难题。目前采用的方法主要是先

的

MIPs

将模板蛋白质通过共价作用或物理吸附至载体表 面，因此其模板方向可控，合成印迹聚合物具有均 一化的印迹位点。

制备蛋白质M

IPs

的方法主要有溶胶-凝胶

),本身难以扩散，并且在交联印迹层中传质阻力 法UM1，多巴胺自聚法114’151，自由基聚合法1161等。其 中，活性可控自由基聚合法制得的聚合物结构可控， 有利于形成精确的印迹位点从而增强识别性能|171。

大，模板难以洗脱和再吸附；其次，蛋白质结构复杂， 构型易变，对温度、|>H和溶液性质敏感，不溶于有

基金项目：

收稿日期：作者简介：通讯作者：

国家自然科学基金，项目号：21406004;2018-05-21杨雪（1992-),女.山西省阳泉市人，硕士，研究方向：从事吸附分离高分子材料的研究c E-mail: YangXue2015@tju.edu.cn, 孙艳（1975-),女，副研究员，博士，从事吸附科学和清洁能源技术领域的应用基础研究—E-mail: sunyan2011@tju.edu.cn.

78

KAFT

当 代化工2019年1月

聚合法作为一种活性可控聚合的方法，通过

端基链）之间保

丙烯酰胺基苯硼酸在亲水核纳米粒子表面的接枝 率，最终得到具有核-壳结构的纳米粒子，由于具有 苯硼酸基团，因此该纳米粒子可对糖蛋|'1进行吸附。 通过对糖蛋白辣根过氧化物酶（HliP)和非糖蛋丨M

BSA吸附洗脱的测定结果表明，可对H丨川进行特异

加人二硫醋或厂硫酯等链转移试剂，使聚合反应在 活性增长自由基与休眠种（R的可能，R上

AFT

持快速的动力学平衡，极大减少了自由基双基终止

AFT

聚合可聚合物的分子量和结构，

而且适用单体范围广，得到的分子量分布窄\"8|。以

RAFT

性吸附，吸附量高，选择性好，并且动力学快。

聚合法的特点为制备具有结构可控，位点

IPs

均一，有精确性印迹位点的M目前采用R

AFT

提供了新思路。

3溶液聚合

溶液聚合法与沉淀聚合不同，从始至终单体和 生成的聚合物均可以稳定分散在溶剂中，是分子印 迹领域中一种常用的方法，常用于在载体表面修饰 蛋白质印迹聚合物层。3.1

“接枝到”（grafting to )法

“接枝到”（grafting to )法指的是RAFT试剂先 在溶液中引发聚合，生成的聚合物通过Si02纳米粒 子表谢的羟基或者载体经过预先修饰的功能基团与 聚合物链具有特定相互作用，实现聚合物接枝到载 体表面。

我国学者张玉奎课题组1231将抗原决定簇法与

KAFT聚合法相结合，以转铁蛋白的抗原决定簇肽

聚合法制备蛋质印迹聚合物主要

有悬浮聚合，沉淀聚合和溶液聚合几种方法。

1悬浮聚合

采用悬浮聚合法制备MIPs简单易行|191,是指单 体中溶解的交联剂和引发剂以油相小液滴的形式悬 浮在水介质中

，一

个小液滴为本体聚合的一个单元，

通过搅拌和分散性控制最终粒径大小，由此可制备 得到微米级的聚合物3

Yang

等12(11首次将R

AFT

聚合应用于蛋白质分子

AFTAD

印迹领域，首先利用小分子R大分子R

试剂，（4-氰基戊 )合成含多糖的

MA

二酸）-4-二硫代苯甲酸酯（C

AFT

试剂。以甲基丙烯酸甲酯（M )为 链为模板制备了可特异性识别转铁蛋A的印迹微 球:首先将硅球用氨基硅烷修饰后，偶联戊二醛， 然后在硅球表面共价接枝转铁蛋n的抗原决定基N 端九肽链，固载模板后，在溶剂中加入功能单体、

RAFT试剂和自由基引发剂引发聚合，洗脱模板肽

功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（E联剂，再加入新合成的大分子R

AFTSA

GDMA

)为交

试剂为油相； )的去离子水

然后加入含有模板牛血清蛋內（B10~70 p

的B

中，在40丈条件下通过机械搅拌制备得到粒径为

m

SA

印迹微球粒子，将含糖聚合物链

聚合制备的

链后得到了印迹微球：该微球对模板抗原决定基的 印迹因子为1.，对转铁蛋白的印迹因子为1.61; 并且在转铁蛋白与细胞色素C的竞争吸附中对转铁 蛋白的印迹因子远高于细胞色素C，具有优良的选 择性。

Zhao等1241通过一步聚合的方法制备得到可以在

醇解为羟基后，亲水性增加。通过与传统自由基聚 合得到的印迹粒子相比较，采用K

MIPs

AFT

降低了非特异性吸附，并提高了选择性。

2沉淀聚合

沉淀聚合是指随着聚合反应的进行，聚合物的 聚合度不断增加，使其在有机溶剂中的溶解度逐渐 降低，最终在溶剂中沉淀析出|2'

Liu

活体细胞中选择性吸附目标蛋白的荧光磁性纳米粒 子。先将自由基引发剂固载至Fe;〇4@Si〇2纳米粒子 表面，然后在缓冲液中加人荧光单体和其它辅助功 能单体，PEG化的亲水性RAFT试剂，通过紫外引 发，制备得到具有亲水性的脱氧核糖核酸酶I印迹 纳米粒子。不仅可以用于活体细胞识别模板蛋白， 而目.可通过PEG的亲水性及抗蛋內吸附性降低非 特异性吸附，提高选择性。

但由于该方法为溶液聚合，并不能保证后加入 的

RAFT

等1221通过两步聚合的方法合成了具有核-壳 )为单体，N,N-亚甲基双内'烯酰胺（M

)

结构的糖蛋内分子印迹纳米粒子。首先以甲基内烯 酸

（MAA

BA

为交联剂，用蒸馏沉淀法制备得到亲水性纳米核， 并且表面可残余大量双键；然后加入2-(十二烧基 硫代羰基硫基）-2-甲基丙酸（R硼酸壳层，通过l《AF

AFT

试剂），通过沉

淀聚合在纳米粒子表面制备了一层聚丙烯酰胺基苯

T

试剂全部位于纳米粒子外表面，导致聚合

聚合可控制聚合速率，增加物壳层内部具有一定量PEG,从而影响单体与目标

第48卷第1期杨雪，等：RAFT聚合法合成蛋白土 V' : ' 一 '79

蛋白的相互作用，不利于形成高亲和性印迹位点。 除此之外，R

AFT

试剂被包埋也不利于对K

AFT

试

剂端基再引发聚合或进行后功能化修饰。而grafting

from

法不具有这样的缺点

3.2 “接枝于”（grafting from )法采用R

AFT

聚合制备MIPs可先将RAFT

试剂通

过不同方法固载至载体表面，使反应在载体表面开 始引发，聚合反应结束后RAFT

试剂仍处于聚合物

外表面，有利于通过对R

AFT

试剂胺解或还原等反 应对MIPs进行后功能化修饰及应用|25]。

由于离子液体可影响蛋白质的水化环境，进而 可以稳定蛋白质结构，因此在印迹蛋白质时可以加 人离子液体为功能单体。Qian等™用两步聚合的方 法以离子液体作为热稳定剂制备了溶菌酶印迹的微 球。先用K

AFT

沉淀聚合的方法制备得到聚甲基丙

烯酸微球，使得表面有一定量的RAFT

试剂；然后

用微球为载体，在缓冲溶液中以溶菌酶为模板蛋白， 离子液体（('hoi dhp )，丙烯酸羟乙酯（H

EA

)为功

能单体，在75 t的条件下用过硫酸铵（APS

)为热

引发剂引发聚合，在其表面成功修饰聚合物层，最 终制备得到可特异性识别溶菌酶的印迹微球。与不 加离子液体合成的印迹微球相比，该印迹微球印迹 效果好，选择性高。Gong等271采用与Qian等类似的 方法制备可识别ADP

-核糖化蛋内的印迹微球。同样

先通过R

AFT

沉淀聚合制备表面含有R

AFT

试剂的微

球粒子；其创新点在于腺苷是adp

-核糖化蛋n最外

表面的组成部分，可以在第二步聚合时以腺苷为模

板，合成的印迹微球可对A

DP

-核糖化蛋白特异性选

择识别。该方法虽与抗原决定簇法类似，同样可以 降低传质阻力，但该方法有效避免了抗原决定簇在 溶剂中有一定链柔性，造成构象改变的不足。

Zhang

课题组12X1以硅球（5 |jl m )为载体，先通

过缩合反应在表面固载丨iAFT

试剂然后以修饰成

功的微球粒子为载体，以溶菌酶（Lyz )为模板蛋门， 在水相中用氧化还原引发剂在40丈引发聚合，洗 脱模板后，得到具有核-壳结构的Lyz-MIPs微球。 结果表明选择性好，吸附动力学快；但载体为微米 球，比表面积不高，形成印迹位点数有限，因此特 异性吸附容量低（5 mg/g )，而且使用的R

AFT

试剂

带有疏水性苯环，不利于在水体系中稳定分散，也 是导致吸附量不高的原因。

以上“接枝于”（grafting from )法得到的MIPs

均为微米粒子，其比表面较低，吸附容量小。若以 纳米粒子为载体，通过提高比表面积可在很大程度 上增加印迹位点数及吸附M。最近Boitard等1291采用

RAFT

聚合在纳米材料表面接枝一层较薄的聚合物

层，合成具有核-壳结构的印迹纳米材料以磁性

Fe.,()4纳米粒子为载体，利用RAFT

试剂的竣基基团

与

PV

,04纳米粒子的铁离子形成配位作用使其固载

至纳米粒子表面。然后通过BSA

与丙烯酰胺（A

Am

)

单体在水中预聚合形成氢键后，将h

述功能化的纳 米粒子分散在其中，加入交联剂MBA

,最后引发聚

合，合成了 B

SA

印迹的磁性纳米粒子。通过不同聚

合时间的各种表征数据表明RAFT

聚合对壳层厚度

及吸附性能具有可控性。在聚合时间为18 h时印迹

效果最佳，对BSA

的吸附量达到294mg/g，并且通

过测定与BSA

相似性质的两种蛋白质吸附表明该 纳米粒子对B

SA

具有特异吸附选择性3

4结束语

通过R

AFT

法制备得到的MIPs结构可控，位点

均质化，有利于解决印迹位点不精确的问题，从而 提高选择性和亲和性。用RAFT

聚合法制备核-壳结

构的

MIPs

可降低传质阻力，在此基础上将其纳米

尺度化增加印迹位点更有利于提高印迹效果。

虽然R

AFT

链转移剂固载至载体表面较闲难，

但在聚合反应结束后R

AFT

端基仍位于外表面，通

过对RAFT

试剂的氧化、还原、胺解或水解等反应，

为

MIPs

后功能化修饰及固载至传感器表面进行蛋

白质分子的识别与定量检测奠定了基础。

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