基因编辑技术

姓名：马涛涛

专业：计算机系（一班）

基因编辑技术

一 简介

基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。利用该技术，可以精确地定位到基因组的某一位点上， 在这位点上剪断靶标 DNA 片段并插入新的基因片段。此过程既模拟了基因的自然突变， 又修改并编辑了原有的基因组， 真正达成了“编辑基因” 。

二 原理

现代基因组编辑技术的基本原理是相同的，即借助特异性 DNA 双链断裂( DNA double-strand breaks DSB s) 激活细胞天然的修复机制，包括非同源末端连接( NHEJ)和同源重组修复(HDR) 两条途径。

非同源末端连接（NHEJ ）是一种低保真度的修复过程，断裂的DNA 修复重连的过程中会发生碱基随机的插入或丢失，造成移码突变使基因失活,实现目的基因敲除。如果一个外源性供体基因序列存在，NHEJ 机制会将其连入双链断裂DSB 位点，从而实现定点的基因敲入。

同源重组修复（HR） 是一种相对高保真度的修复过程，在一个带有同源臂的重组供体存在的情况下，供体中的外源目的基因会通过同源重组过程完整的整合到靶位点，不会出现随机的碱基插入或丢失。如果在一个基因两侧同时产生DSB，在一个同源供体存在的情况下，可以进行原基因的替换。

三

基因编辑技术的种类

目前主要有 3 种基因编辑技术， 分别为：

1. 人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc- finger nucleases，ZFN)技术；

2. 转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases，TALEN)技术；

3. RNA 引导的 CRISPR- Cas 核酸酶技术(CRISPR- Cas RGNs)。

四 基因编辑技术的应用前景

1. 基因功能研究

基因敲除是在活体动物上验证基因功能必不可少的逻辑环节， 但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、 ES 细胞筛选、 嵌合体动物模型选育等一系列步骤， 成功率受到多方面因素的。

即使对于技术比较成熟的实验室， 利用传统技术敲除大鼠或小鼠身上的某个基因一般也需要 1 年以上。基因编辑新技术则不然， 敲除基因高效快速， 是研究基因功能的有力工具。

ZFN 技术已在大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、拟南芥、玉米、烟草 等模式生物或经济物种的细胞或胚胎中以及包括诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)在内的人体外培养细胞系中成功地实现了内源基因的定点突变，其中在果蝇、 斑马鱼、大鼠等物种中还获得了可以稳定遗传的突变体。

2009 年， 威斯康辛医学院、 Sangamo Biosciences、 Sigma- Aldrich 等多家机构使用 ZFN 技术，成功培育出首只靶基因敲除的大鼠，而且带有该突变的大鼠所生育的后代同样带有该基因突变。

2. 基因治疗

传统的基因治疗是将正常的基因片段引入细胞中替代有缺陷的基因， 但这种方法难以精准控制， 可能产生很大的毒副作用。基因编辑新技术可以精确定位， 在靶位点进行修正或进行基因切除， 达到基因治疗的目的。

Bacman 等人利用 TALEN 技术清除了来自于病人线粒体内的有病 DNA。这是 TALEN 首次应用于线粒体基因的编辑，这项研究有望用于治疗母系遗传的线粒体病。

Li 等人利用 ZFN 技术能在染色体上精确定位的优势， 通过 “剪切” 和 “粘贴” 基因， 在实验小鼠体内实现了血友病治疗， 避免了传统基因疗法带来的插入诱变风险， 首次取得了基因组编辑在基因疗法上的突破。

3. 构建模式动物

根据人类疾病所构建的动物模型，对研究这些疾病的发生及其治疗有着重要意义。基因打靶技术是在 ES 和同源重组技术的基础上发展起来的，模型构建耗时长、成本高，且模式动物的选择受到 ES 细胞的。

基因编辑新技术不受 ES 细胞的，效率高，速度快，且定点编辑更加精确，可在多种细胞及生物体的特定位点进行切割和修饰。构建转基因小鼠第一人 Jaenisch 与其同事最近利用 CRISPR- Cas 系统又构建了携带特异性突变的小鼠模型。

4. 改造和培育新品种

传统的改造动植物品种的转基因技术是将外源 DNA 片段插入受体的基因组中，改造基因功能，使其表达优良的性状，获得人类需要的品种。基因编辑技术则可以进行定点修饰， 达到高效定向。 Shukla 等对玉米进行肌醇磷酸激酶 1(inositol phosphate kinase 1，IPK1)基因的修饰，使其对除草剂的耐性增强，在发育的种子中肌醇磷酸盐表达谱也发生了与预期一样的改变。 Townsend等以烟草中的丙酮醇合酶(acetolactate synthase)基因 SuR (SuRA和SuRB)位点为靶标，育成了对咪唑啉酮(imidazolinone)除草剂和对磺脲(sulphonylurea)除草剂都有抵抗力的新品种。

五 基因编辑技术优点

与传统的以同源重组和胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)技术为基础的基因打靶技术相比，基因编辑新技术保留了可定点修饰的特点，可应用到更多的物种上，效率更高，构建时间更短，成本更低。

六 基因编辑技术缺点

1.技术难题

基因编辑是一项新技术， 还存在构建复杂和价格的问题， 其脱靶效应了其在基因治疗等应用上的发展。

2.伦理争议

基因编辑技术其实面临很大的与医学伦理争议，尤其是对人类胚胎DNA编辑，一经亮相就登上各大头条并引起广泛关注。相关研究的每次发布都能产生一石激起千层浪的强烈反响。

继去年中山大学黄军教授在Protein and Cells上发表的第一篇关于人类胚胎基因编辑研究，广州范勇博士团队于今年4月份发表在J Assist Reprod Genet全球第二篇研究论文（运用人类胚胎基因编辑技术实现HIV免疫）。这两次发表都引起了Nature、Science等国际顶级期刊的极大关注和激烈讨论。出于一种对于改变人体基因组的后果的畏惧，伦理学界的一些人已经呼吁对其全面禁止。那些支持谨慎地进行基因编辑临床应用的人则强调这项技术治疗罕见单基因疾病的潜力。

争论的结果是美国国家科学院为此专门召开了一次国际科学家峰会，峰会的共识是，对人类胚胎的基因编辑可用于基础研究，但禁止临床应用。

鉴于科学的迅猛发展，基因编辑很可能在2016年继续占据科学主流问题的地位。CRISPR需要有合适的运用场景，在技术层面上，CRISPR-Cas尤其是其核心技术CRISPR-Cas9虽然新颖，但尚有“脱靶”这样的主要问题和许多的技术难点需要突破。