超氧化物歧化酶活性测定

超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定

一、原理

将25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%所需的SOD定义为一个活力单位。在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化，可根据SOD抑制邻苯三酚自氧化能力测定SOD活力。

二、试剂

1、A液：PH8.20 0.1mol/l三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（内含1mmol/LEDTA·2Na）。称取1.2114g三羟甲基氨基甲烷和37.2mgEDTA·2Na溶于62.4ml0.1mol/l盐酸溶液中，用蒸馏水定溶至100ml。

2、B液：4.5mmol/l邻苯三酚盐酸溶液。称取邻苯三酚56.7mg溶于少量10mmol/l盐酸溶液，并定容至100ml。

3、盐酸溶液：10mmol/l

4、蒸馏水：二重石英蒸馏水。

三、仪器

1、紫外-可见分光光度计；

2、精密酸度计，0.01PH；

3、离心机；

4、10ml比色管；

5、10ml离心管；

6、玻璃乳钵。

四、测定步骤

1、植物超氧化物歧化酶样品1.00g置于研钵中，加入9.0ml蒸馏水研磨5分钟，移入10ml离心管。用少量蒸馏水冲洗研钵，洗液并入离心管中，加蒸馏水至刻度，经4000r/min离心15分钟，取上清液测定。

2、在25℃左右，于10ml比色管中依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.00ml，B液0.15ml。加入B液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325nm波长条件下初始时和1Min后吸光度值，二者之差为邻苯三酚自氧化速率△A325（min-1）为0.060。

3、在25℃左右，于10ml比色管中依次加入20.0ul样液或酶液，A液2.35ml，蒸馏水2.00ml，B液0.15ml。加入B液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325nm波长条件下初始时和1分钟后吸光度值，二者之差为样液或酶液抑制邻苯三酚自氧化速率△A′325（min-1）。加入样液或酶液的量使抑制邻苯三酚自氧化速率为1/2△A′325（min-1），即0.030。

五、计算结果

式中：

V—加入样液或酶液的体积，ml

△A325—邻苯三酚自氧化速率

△A′325—样液或酶液抑制邻苯三酚自氧化速率

D—样液或酶液的稀释倍数

V1—样液总体积，ml

4.5—反应液总体积，ml

m—样液的质量，ml