牛血清在细胞培养中的作用

牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。

1.提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。

2. 提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。

3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。

4.是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。

5.起酸碱度缓冲液作用。

6.提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。

二、 牛血清的主要成份

血清是一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已为人所知，但还有一部分尚不清楚，而且血清组成及含量常

随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。

1.蛋白质是牛血清中主要成份。除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白，球蛋白。

纤维粘连素 细胞促进细胞附着；

α2 巨球蛋白 抑制胰蛋白酶的作用；胎牛血清中含胎球蛋白 促细胞附着；转铁蛋白 能结合铁离子，减少其毒性 和被细胞利用。

2.多肽：血小板促生长因子能促细胞，是多肽家庭的主要成员之一，是主要的促细胞增殖因子；成纤维细胞

生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。

3.激素：激素对细胞的作用是多方面的。

胰岛素：促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞有关。

类胰岛素生长因子：能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用。 促生长激素：促细胞增殖效应。

氢化可的松：血清中含有定量的该成分，它可能兼有促细胞贴附和增殖作用，但有人证明，血清中的氢化可的松

，如细胞密度高时可能有抑制细胞的作用和诱导其发生分化。

4其他成份

氨基酸、葡萄糖、酮酸等对多种营养成分的合成培养基意义不大。与蛋白相结合状态的微量元素对细胞培养有意 义。

三、 牛血清的质量要求

随着科学技术的发展和生活水平的不断提高对生物医药产品的质量要求也越来越高，所以对制备工艺中所涉及到

的各种原材料的质量标准要求也越来越高，特别是对用于细胞培养基中的主要天然成份――牛血清的质量要求也

不断提高。牛血清包括胎牛血清、新生牛血清和成牛血清。

(一)、WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求：

1. 牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家。并应具备适当的监测系统。

2.有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。

3.证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。

4.血清要通过滤膜过滤除菌，保证无菌。

5.无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染，有些国家要求无细菌噬菌体污染。

6.对细胞有良好的支持繁殖作用。

(二)、我国在对牛血清的质量2000年版《中国生物制品主要原辅料质控标准》中提出比较严格的标准要求。包

括蛋白质含量，细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素，支持细胞增殖检查。

(三)、美国对牛血清的质量要求：Gibco 和Sigma二家主要的美国牛血清供应商的牛血清都已进入到我国市场，

他们对其质量标准要求都极为严格，从血清来源到产品质量都有明确规定。

1) 血清来源：可从世界各国收集胎牛血清，但是必须符合他的质量标准和美国农业部进口要求。地方当局还不

清楚本地是否有牛海绵状病毒流行的血清不收集，有说明血清质量的证明资料：包括收集过程的全部资料、检验 结果和交付情况。

2)血清的收集：胎牛血清是心脏穿刺取血，新生牛(10～14天)和小牛(10个月内)血清静脉取血。血清采集条

件必须符合工业生产的标准：低温下采集、一次分离、分离后立即混合冻存。符合要求的血清56℃水浴30分钟灭

活。

3)血清的制备：

a. 超低IgG胎牛血清：通过亲和层析工艺去除胎牛血清中的γ球蛋白，使FBS γ球蛋白含量减到最低，一般IgG≤5ug/ml，生物学活性不变。

b. 血清透析：用12000～14000分子量的透析膜在0.15M NaCl中透析直到使葡萄糖含量＜0.5mg/ml(用葡萄糖氧

化酶／过氧化酶方法测定)。

c. γ－射线照射：已经证明γ－射线照射可以有效灭活血清中可能污染的病毒、支原体。照射剂量为30～45KG。

而且这个剂量的γ－射线照射不会改变血清的理化性质和对细胞培养的影响。

4)除菌过滤:经过上述处理的粗制血清再经过一系列除菌滤膜过滤包括0.2微米(micron)和0.1微米滤膜。FBS要

通过三层0.1微米滤膜，其他血清可通过0.2微米滤膜。

4.终产品血清质量

1)化学检定：渗透压

pH

蛋白含量――电泳法

白蛋白 球蛋白 血红蛋白

随着牛年龄增加血清中总蛋白含量相应增加，总的血清蛋白含量可以确定产品规格和年龄。 2) 微生物学检查：细菌、真菌符合USP标准。

支原体：在支原体专业培养基上培养了3～4周，培养温度36℃±2℃

分别在需氧和厌氧条件下进行，有的还需要在支原体琼脂培养皿上传4次，Hoechst荧光素DNA染色检查那些培养法

无法检出的支原体如猪鼻支原体等。

病毒检查：

牛兰舌病毒 Bovin blue tongue 牛腺病毒 Bovine Adenovirus

牛细小病毒 Bovine Parvovirus

牛病毒性腹泄病毒 Bovine Viral Diarhea Virus 狂犬病病毒 Rabies 呼肠弧病毒 Reovirus

牛呼吸道合胞病毒 BRSV 副流感病毒Ⅲ型 Parainfluenza

检查方法：

已证明无外源因子污染的牛细胞培养物，在细胞生长液中加15％待测血清，连传3代共21天。阴性对照细胞培养液

中加15％已知无病毒污染的牛血清，与试验组同条件下进行。在观察期内注意细胞形态变化或细胞病变。在观察

期内第14天待检样品和对照样品用标准病毒检测方法检查。

如待检细胞培养物经胰酶消化后分种到6个含盖玻片的容器内。阴性对照样品按同样方法。再将牛腹泄病毒、牛细 小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼肠弧病毒分别加入待检培养物盖玻片容器内作为阳性对照，再培养7天，用荧光 抗体技术进行检查。

细胞病变或病毒引起的其他改变通过苏木精或伊红染色进行观察。取另外一个待检细胞培养瓶用人“O”红细胞、

豚鼠红细胞和新鲜鸡红细胞作血球吸附病毒检查。试验在2～8℃和20～24℃进行。阴性对照细胞预先感染副流感

Ⅲ型病毒作为阳性对照。未感染的细胞作为阴性对照。

3)内毒素检测 用鲎试剂检查。

4)细菌噬菌体检查

主要检查E.Coli(C300 or K-12)噬菌体。

5)激素含量测定

每批FBS对某些激素含量都要进行测定，包括：雌二醇、胰岛素、孕硐、睾丸素、甲状腺素等。

6)血红蛋白检测

血红蛋白与氧合血红蛋白的比≥70％，血红蛋白含量≤mg15/dl。

7)细胞生长效果测定

a.细胞克隆效果测定

细胞选择：Sp20/Ag-14 或P3X63-Ag8.653 血清浓度与细胞数:

10％血清／1个细胞／孔

4％血清／5个细胞／孔

细胞培养基RPMI－10， 96孔培养盘36℃±2℃，5％二氧化碳培养10～ 15天。试验中选择一个已知参考牛血清作对照。 克隆效率计算：

克隆效率＝(阳性孔平均数/ 培养孔总数) X100％

相对克隆效率＝待测血清克隆效率/参考血清克隆效率

b.贴壁效率试验：

用人的传代细胞作每批血清的贴壁效率试验，A9(人肺癌细胞)该细胞可以反应出低浓度血

清的贴壁变化。采

用6孔培养盘每批血清用两种浓度和两种不同的细胞接种数即10％血清――100细胞／孔，4％血清200介细胞／孔

。放36℃±2℃，湿润5％二氧化碳培养箱培养10～14天，计算着色细胞克隆，确定贴壁效率。从这两种不同血清

浓度来确立实验血清支持细胞贴壁生长的水平，分析两种试验条件下平均贴壁效率。

贴壁效率(％)＝(每孔克隆平均数/ 每孔活存的培养细胞平均数) X100％

相对贴壁效率＝被测血清贴壁效率/参考血清贴壁效率 c. 二倍体纤维细胞促生长试验 人二倍体细胞株 WI28 MRc5

25cm2细胞培养瓶，5％血清，每瓶接种1.5X105细胞连传3代，每代血清浓度和接种细胞数相同，每代培养7天，每

代接种二个细胞瓶，36℃±2℃培养。以同样条件用已知参考血清进行平行培养。每代收获细胞计数，计算每批待

检血清与参考血清的相对生长率(RGR)。

RGR＝(试验血清每瓶细胞平均数/ 参考血清每瓶细胞平均数) X100％

牛血清主要质量要求(Sigma)

胎牛血清 新生牛血清 成牛血清 牛龄 胎 10～14天 ＜10个月 无菌 － － － 病毒 － － －

支原体 － － － 噬菌体 － － －

内毒素(ng/ml) ≤1.0 ≤10.0 ≤10(15) 血红蛋白(g%) 3.0～4.5 3.5～6.0 5.0～8.5 pH 6.7～8.0 7.0～8.0 7.0～8.0

渗透压(mom/Kg H2O) 240～340 240～340 240～340

牛血清在细胞培养中的作用及产生的常见问题(2)

现代生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切的关系，特别是在生物医药领域，细胞培养更具有特殊的作用。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多都是通过细胞培养来实现的，基因工程乙肝疫苗大多是以CHO细胞作为载体；基因工程抗体药物的制备也离不开细胞培养。细胞工程领域更离不开细

胞培养技术，杂交瘤单克隆抗体的研究制备完全是通过细胞培养来实现的，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。细胞培养的发展，培养基的质量是关键，而培养基的构成中动物血清对细胞的生长繁殖起着重要作用。在动物血清中牛血清的应用又是最广泛的，所以牛血清的质量直接影响生物制品的质量和安全性。 一、牛血清的主要成分

牛血清是一种成分复杂的混合物，其大部分成分已为人所知，但还有一部分仍不清楚，而且血清的组成及含量通常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而存在差异。牛血清主要成分有以下几类：

1、蛋白质类包括白蛋白、球蛋白、α-巨球蛋白(抑制胰蛋白酶的作用)、胎球蛋白(促进细胞附着)、转铁蛋白(能结合铁离子，减少其毒性和被细胞利用)、纤维粘连素(促进细胞附着生长)等；

2、多肽类主要是一些促进细胞生长和的生长因子，最主要的生长因子是血小板生长因子，还有成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，虽然在血清中含量很少，但对细胞的生长和也起着重要作用； 3、激素类激素对细胞的作用是多方面的。包括：

胰岛素：促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞有关；

类胰岛素生长因子：能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用： 促生长激素：促进细胞增殖的效应；

氢化可的松：血清中含有微量该成分，它可能具有促细胞贴附和增殖作用。但有人证明，血清中的氢化可的松，在细胞密度较高时可能有抑制细胞生长和诱导细胞发生分化的作用。/ 4、其他成分如氨基酸、葡萄糖、微量元素等。在合成培养基中这些成分的作用并不明显，

与蛋白相结合的微量元素对细胞生长起促进作用。0 二、牛血清在细胞培养基中的主要功能

牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。

1、提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；

2、提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；

3、是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源； 4、起酸碱度缓冲液作用；

提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。

三、牛血清的分类

根据牛出生时间和血清采制分离方法分为： 1、胎牛血清：八月龄胎牛心脏穿刺取血；

2、新生牛血清：出生12-24小时新生牛静脉采血；3 高级新生牛血清：采血后静置自然析出的血清；' 标准新生牛血清：经离心分离的血清；* 普通新生牛血清：融血或微融血的血清； 2、小牛血清：出生三月龄小牛动脉采血分离血清； 四、牛血清的质量要求; T8 G1 _ t, J%

（一）WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求

1. 牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家，并应具备适当的监测系统。

2.有些国家还要求牛血清来自没有用过反刍动物蛋白饲料喂养的牛群。2 T! p\" y5 G/ s 3.要能证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。 4.血清要通过滤膜过滤除菌，保证无菌。

5.无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染，有些国家要求无大肠杆菌噬菌体污染。- k/ t+ W- M) t 6.要求血清对细胞有良好的支持繁殖作用。

（二）我国在对牛血清的质量标准最早在2000年版《中国生物制品主要原辅材料质控标准》中提出。包括物理性状、总蛋白，血红蛋白、细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素，支持细胞增殖检查。2005版药典颁布之后，小牛血清质量标准被纳入《中国药典》2005年版 第三部 生物制品分册。 （三）美国对牛血清的质量要求：

Gibco 和hyclone等美国主要血清供应商的牛血清都已进入到我国市场，他们对血清质量标准有严格要求，从血清来源到产品质量都有明确规定。,

1、血清来源 ：可从世界各地收集胎牛血清，但必须符合其质量标准和美国农业部进口要求。 2、血清的收集：必须符合工业生产的标准，低温采集，一次分离，分离后立即混合冻存。 3、血清的制备：超低IgG胎牛血清、透析血清、γ-射线辐照；\" 4、除菌过滤：0.22μm和0.1μm滤膜过滤； 5、成品分装：根据需要分装成不同规格。 五、牛血清质量检定指标(

1、化学检定：包括渗透压（240～340）、pH（7.0～8.0）、总蛋白含量（3.5～5.0％）、血红蛋白 （≤0.02％）) {.

2、微生物检查：细菌和真菌——直接培养法、噬菌体——噬斑法和增殖法 支原体——培养法和DNA染色法 、牛病毒——细胞培养法。要求均为阴性

3、内毒素检测——凝胶法和动态浊度法 要求内毒素含量≤10EU/ml 4、促细胞生长测定（SP2/0-Ag14标准规定）

1）最大增殖浓度≥1.0×106个/ml、倍增时间≤20小时

克隆率＝（阳性孔平均数/培养孔总数）×100％, w2 Z9 X8 _9 H' F+ [( a0 r5 D$ p 2）贴壁效率（ VERO细胞、二倍体细胞等） 10％血清――50或100个细胞/孔

贴壁效率（％）＝（每孔克隆平均数/每孔存活的培养细胞平均数）×100％3 O* j+ M) p4 }& V1 相对贴壁效率＝被测血清贴壁效率/参考血清贴壁效率

以上项目检定结果应符合2005版《中国药典》第三部的相关规定。血清厂家应在此基础上结合疫苗病毒生产工艺建立企业内控检定项目并建立相应的检定方法，保证疫苗病毒生产的稳定性，提高疫苗制品的质量。

六、牛血清的使用所产生的常见问题

（一）由于血清营养丰富，贮存条件特殊，因此在贮存和使用过程中容易产生以下问题： 1、改变培养液的pH值3

牛血清的pH理论值为7.0～8.0，培养基在加入规定量的碳酸氢钠后（即达到细胞生长所需要的渗透压），再加入10％的牛血清，一般会使培养液的pH值发生改变。因此在使用过程中应注意PH的变化，如有必要可用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调pH到所需值。

2、由于血清的营养成分丰富，非常适合细菌、真菌和支原体等生长。国产血清大部分采用手工分装，因此容易把微生物带入而使得血清被污染。使用前如果没有及时发现，将会把污染物带入正在培养的细胞中，而使得细胞不能正常生长。

3、血清在贮存解冻过程中会产生沉淀，这是由于血清中含有大量脂蛋白、纤维蛋白及多肽类物质，在-15℃冷冻保存解冻后就会自然形成沉淀，随着保存时间的延长，沉淀量会增加。因此在

融化血清时一般应先在4 ℃放置使之解冻，然后放在室温使血清完全融化，以避免沉淀的增加。添加血清时应避免把沉淀加入培养液，否则由于沉淀的存在会使得所培养的细胞产生大量黑点，或者细胞表面将会覆盖一层油状物质，影响细胞的正常生长。为减少血清的损失，可以把有沉淀的血清收集起来进行离心处理，将上清液加入培养液使用（一般不建议采用过滤的方法除去沉淀，因为沉淀会堵塞滤膜而无法过滤）。3 S7 v, h* | （二）大规模细胞培养中牛血清对细胞及病毒滴度的影响

血清是一种成分复杂的混合物，不同批次血清对细胞生长的促进作用不同。大规模细胞培养中由血清引起的细胞生长状态不佳及病毒滴度的影响表现在以下几个方面：' X4 G! U) w0 x8 {# 1、细胞生长速度缓慢，长满单层时间长；从同一细胞瓶中分出两瓶细胞，用同一种培养液，分别加入10％的对照血清和待检血清，在相同条件下培养72小时，会出现对照血清长满单层，而待检血清大约只有60～70％，这种血清就不适合用来大规模培养细胞。

2、细胞传代后形态不正常，细胞状态发生变化 ；由于血清的质量问题，使原本状态正常的细胞经传代后形态会变差；比如：细胞瓶里会出现一些蠕动的小黑点（并非污染），或者细胞表面形成一层油状覆盖物；细胞的轮廓变得模糊，细胞之间的间隙被血清中的蛋白颗粒填充，从而影响细胞向四周扩展生长。5 V6 T. C

3、细胞传几代后就出现脱壁现象，不能连续传代 ；质量较差的血清缺乏某种细胞的贴壁因子，会使细胞在传代过程中逐渐丧失贴壁的能力。细胞会从正常的贴壁状态，边缘开始萎缩，上翘。观察到的现象就是细胞表面不光滑，晃动细胞瓶会看到细胞表面有絮状物随培养液波动。随着传代次数增加，细胞萎缩的情况越来越严重，直到最终完全脱壁而死亡。

4、细胞长的很好，致密的单层，状态也很正常，但是接毒后细胞基本不发生病变，做滴度检测几乎测不出抗原滴度。这种情况也许是因为血清中含有与接种的病毒有同源的特异性抗体。比如血清中经常会存在乙脑抗体，牛腹泻病毒抗体等，如果存在这些抗体，就会把接进去的病毒给中

和掉。如果抗体滴度很高，病毒会被抗体完全中和，就没有病毒颗粒在细胞中增殖，所以会检测不到病毒滴度。这种情况给疫苗企业造成的损失是相当大的，不产毒等于前面所做的那么多工作全部白费，浪费人力、物力，尤其是时间上的浪费，从培养细胞开始到接病毒，到收液至少需要一两个月，一旦出现不产毒的情况，那么这一两月时间就白白浪费掉了，这也是牛血清给疫苗企业造成的风险之一。

5、细胞生长的状态一般，产毒少，毒价低。这种情况比较常见，细胞是病毒的载体，由于血清质量不好，导致细胞生长状态不好，病毒就无法进行正常的复制。并非所有病毒都不能复制，所以就造成疫苗的效价不够，可能造成不合格产品。